39 Selanjutnya 600 µl campuran dipindahkan ke dalam kolom GD. Campuran
kemudian disentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 2 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang. Kemudian ditambahkan buffer W1 sebanyak 400 µl.
Campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 1 menit. supernatan yang terbentuk dibuang kembali. Selanjutnya ditambahkan buffer Wash sebanyak
600 µl. Campuran disentrifugasi kembali, dan supernatan yang terbentukdibuang kembali. Selanjutnya dilakukan sentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 3
menit.
Kolom GD dipindahkan ke mikrotube 1.5 ml yang baru. Selanjutnya ditambahkan 50 µl elution buffer yang telah dipanaskan pada 60
C tepat ditengah kolom. Kemudian didiamkan kolom selama 5 menit. Dan dilakukan sentrifugasi
kembali 14.000 g selama 1 menit. Sample disimpan pada suhu -20 C.
4.2.3 Primer yang Digunakan
Primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan primer yang bersumber dari TropGene Cirad
Tabel 2.
4.2.4 Analisis Kuantifikasi dan Kualitifikasi DNA
Analisis kuantifikasi dan kualifikasi dilakukan dengan menggunakan alat Nano Drop 2000 spectrophotometer yaitu dengan mengukur absorbansi DNA
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Penentuan kualitas DNA dapat dilakukan dengan menghitung rasio absorbansi pada A260 dengan A280. Nilai
rasio yang mendekati 2 menunjukkan tingkat kemurnian yang tinggi. Namun semakin rendah nilai rasio tersebut maka semakin rendah kualitas DNA akibat
adanya kontaminasi protein.
Penentuan kualitas juga dilakukan menggunakan metode elektroforesis. Pita DNA genom yang memiliki kualitas yang baik akan tampak sebagai pendar
tak putus pada gel agaros setelah proses elektroforesis. Gel yang digunakan adalah gel agarosa dengan konsentrasi 1 1 gram agarosa dalam 100 mL TAE 1x
0.04M Tris Asetat; 0.001M EDTA.
Genom DNA hasil isolasi sebanyak 5 µL dicampur dengan 1 µL loading dye [0.25 wv Bromfenol biru, 30 wv sukrosa dalam air]. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel elektroforesis yang direndam TAE 1X dalam chamber elektroforesis Mupid ®-exU, Advance. Proses
elektroforesis dilakukan selama 30 menit dengan tegangan 100 Volt.
Gel hasil elektroforesis dimasukkan kedalam etidium bromide selama 5 sampai 10 menit kemudian dibilas dengan akuades. Hasil pewarnaan kemudian
diamati menggunakan
UV Transilluminator
Major Science
dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera.
4.2.5 Amplifikasi PCR
Pencampuran PCR master Mix dan primer dilakukan menggunakan mesin Qiagility yang bekerja secara robotik mencampur komponen PCR seperti Buffer,
dNTP, MgCl2, dan DNA polymerase. Dalam percobaan ini 7.5 µl KAPA 2G Fast Ready Mix 2x, 2.2 µl nuclease free water, 0.15µl primer forward 10 µM, IDT,
0.15 µl primer reverse yang diberi label fluorescent yang digunakan dalam penelitian ialah 6-carboxy-fluo-rescine FAM, hexachloro-6-carboxy-fluo-
rescine HEX, 6-carboxy-X-rhodamine ROX, dan tetrachloro-6-carboxy-
40 fluorescine
TET 10µM, IDT. Hasil dari pencampuran tersebut selanjutnya diikuti dengan pencampuran 5µl DNA contoh 10 ng per reaksi
Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR Veriti® Thermal Cycler Applied Biosystem. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan tahapan
amplifikasi sebagai berikut: Tahap denaturasi pada 95
o
C selama 15 detik, annealling pada 52
o
C selama 15 detik dengan penurunan suhu sebesar 0.2
o
C setiap siklus, dan tahap perpanjangan pada 72
o
C selama 5 detik, 25 siklus amplifikasi 95
o
C selama 15 detik, 50
o
C selama 15 detik, 72
o
C selama 5 detik dan tahap perpanjangan akhir 72
o
C selama 10 menit.
4.2.6 Analisis Marka SSR
Enam belas Marka SSR dengan tingkat polimorfisme yang tinggi digunakan dalam penelitian ini. Marka-marka tersebut diperoleh dari TropGENE
Cirad Tabel 2. Penanda SSR diberi label pada primer reverse dengan penanda berpendar FAM, ROX, HEX atau TAMRA. Amplifikasi PCR dilakukan dengan
menggunakan reagen Kapa 2G Fast Polymerase
TM
Kapa Biosystem dengan menggunakan alat Veriti 96 well Thermal cycler Applied Biosystems dan
fragment analysis dilakukan oleh pihak ketiga First Base Laboratories, Malaysia.
4.2.7 Analisis Hasil Amplifikasi Alel Mikrosatelit
Hasil amplifikasi dari lokus-lokus mikrosatelit pada genom kelapa sawit disekuensing menggunakan jasa pihak ketiga First Base. Hasil sekuensing
didapatkan dalam bentuk format .FSA yang akan dianalisis menggunakan perangkat lunak GeneMarker® versi 2.20 trial SoftGenetics, USA; warna
standar merah dan tipe analisis fragmen plant. Data hasil pembacaan dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Cervus, Colony dan Structure untuk
analisis tetua. Sedangkan software GenALEX 6.3 Genetic Analysis in Excel Peakall dan Smouse 2006 digunakan untuk menganalisis keragaman genetiknya.
4.3 Hasil Dan Pembahasan 4.3.1 Jumlah Alel yang dievaluasi dalam populasi kelapa sawit
Total jumlah allel SSR yang diperoleh sebanyak 105 alel dari total 16 lokus yang digunakan. Rata-rata jumlah allel lokus
-1
cukup tinggi yaitu sebanyak 6.56 allel Tabel 12 . Pada kombinasi seluruh populasi, lokus mCnCIR0038
memiliki nilai jumlah alel lokus
-1
yang tertinggi yaitu 9 alel lokus
-1
Tabel 12. Sedangkan, lokus mEgCIR0353 dan mEgCIR0173 memiliki jumlah alel lokus
-1
yang paling rendah, yaitu 3 dan 4 alellokus secara berutan Tabel 12. Evaluasi pada populasi D x D self,total alel yang diperoleh yaitu 132 alel
dengan rata-rata alel lokus
-1
sebesar 8.25 alel lokus
-1
. Sedangkan pada populasi T x T, total alel lokus
-1
sebesar 40 dengan rata-rata hanya 2.5 alel lokus
-1
nya. Lebih lanjut, total alel pada seluruh populasi berkisar antara 40 sampai 70, dengan rata-
rata alel lokus
-1
berkisar antara 2.5 sampai 4.375 Table 2. Hal ini sesuai dengan hasil yang dilaporkan oleh Taeprayoon et al. 2015, Okoye et al. 2016a, b dan
Bakoumeet al. 2007 yang melaporkan masing-masing jumlah alel lokus
-1
dari populasi yang mereka miliki bervariasi satu sama lain yaitu pada kisaran 1.33
sampai 22 alel lokus
-1
.
41 Tabel 12. Jumlah alel yang diobservasi untuk tiap marka SSR pada populasi
kelapa sawit yang diuji
Jumlah alel lokus
-1
pada populasi C22 dan B57 menunjukkan jumlah yang sesuai dengan yang diperkirakan Tabel13. Namun pada populasi dura A125,
A127, dan A 140 terdapat jumlah alel per lokus yang lebih besar dari yang diperkirakan dengan rata-rata 7 alel lokus
-1
. Tabel 13. Kesesuaian jumlah lokus alel
-1
dan rasio frekuensi alel
Population Total
loci Loci having number of
allelelocus Loci having ratio of allele
frequency Fit to the
expected Larger than
expected Fit to
expected Unfit to
expected C22
16 16
11 5
B57 16
16 8
8 A140
16 9
7 5
4 A125
16 9
7 4
5 A127
16 9
7 3
6
Sama dengan hasil yang diperoleh pada Bab 3, Jumlah alel lokus
-1
untuk beberapa lokus dari populasi yang dievaluasi lebih tinggi dari nilai yang
diharapkan dalam model frekuensi alel berdasarkan genetika Mendel Tabel 4 .
Locus LG
Number of Alleles of each locus for Populations : A125
A140 B57
C22 DuraSelf
TxT TxD
All mEgCIR0802
1 3
5 3
3 8
3 3
8 mEgCIR3282
2 5
3 3
2 8
3 2
7 mEgCIR0173
3 2
1 1
3 3
1 3
4 mEgCIR3533
4 5
4 2
3 9
2 3
5 mEgCIR2813
5 4
2 2
2 6
2 2
5 mEgCIR3543
6 7
4 3
3 11
3 3
8 mEgCIR0894
7 5
5 3
3 10
3 3
8 mEgCIR0886
8 6
3 3
3 9
3 3
7 mEgCIR3886
9 2
3 3
3 5
3 3
6 mEgCIR3785
10 4
6 3
3 10
3 3
8 mEgCIR3362
11 6
5 3
4 11
3 4
8 mEgCIR2414
12 4
3 3
3 7
3 3
6 mCnCIR0038
13 8
5 2
4 13
2 4
9
mEgCIR3546 14
4 5
2 4
9 2
4 5
mEgCIR3292 15
4 5
3 4
9 3
4 8
mEgCIR0353 16
1 3
1 1
4 1
1 3
Total alleles 70
62 40
48 132
40 48
105 Average
4.375 3.875
2.5 3
8.25 2.5
3 6.56
25
