13
Gambar 5. Bagan penyebab terjadinya Illegitimasi pada persilangan pemuliaan kelapa sawit Hama-Ali et al. 2015
Aplikasi penggunaan parentage analisis dalam kegiatan pemuliaan kelapa sawit salah satunya adalah untuk mengetahui kebenaran tetua persilangan.
Illegitimasi kontaminasi persilangan menjadi faktor yang tidak terlihat yang memiliki pengaruh negatif pada kegiataan persilangan. Menurut Hama-Ali 2015
Illegitimasi dapat terjadi pada berbagai fase persilangan, dari mulai fase inisiasi pembungaan, pelabelan tetua, sampai pelaksanaan penanaman bibit dilapangan
Gambar 5. Banyak faktor yang dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi persilangan baik secara biologi tanamannya seperti munculnya pembungaan
hermaprodit, akibat kesalahan manusia saat pengambilan pollen dan faktor-faktor eksternal seperti rusaknya kantong polinasi sungkup yang disebabkan oleh
serangga maupun tikus, serta terjadinya penyerbukan bebas oleh serangga penyerbuk Elaeidobius kamerunicus. Sebelum adanya teknologi berbasis
molekular dan marka codominant seperti mikrosatelit, sangat sulit menentukan terjadinya kontaminasi persilangan. Para pemulia harus menunggu beberapa
tahun sampai tanaman mengalami fase generatif, untuk mengecek terjadinya kontaminasi dengan cara yang tradisional dengan memeriksa ketebalan cangkang
dan membandingkan pola segregasinya.
2.7 Penggunaan Penanda Molekuler Simple Sequence Repeat SSRMicrosatelit dengan metoda Mutiplex PCR
Saat ini penanda molekuler berbasis polymerase chain reaction PCR telah digunakan secara luas di dalam penelitian pemuliaan dan genomik suatu
organisme. Penanda molekular mampu mendeteksi genetika suatu organisme secara cepat dan efisien. Salah satu metoda penanda molekular yang saat ini
banyak digunakan yaitu Simple Sequence Repeats SSRMikrosatelit.
14 Beberapa penulis mendefinisikan mikrosatelit sebagai pengulangan dari 2
sampai 8 bp, atau pengulangan dari1sampai 6 bp atau bahkan 1 sampai 5 bp. Mikrosatelit dihasilkanberasal dari daerah yang merupakan ragam sederhana dari
motif berulang sekuen DNA yang telah terwakili. Mekanisme mutasi dominan pada mikrosatelit merupakan fenomena tergelincirnya proses perpasangan untai
DNA. Proses terjadi ketika sintesa DNA dalam array mikrosatelit mengalami slipped strand mispairing, yang berakibat pada bertambah atau berkurang satu,
atau lebih sekuens unit berulang, bergantung pada apakah yang keluar adalah dari rantai DNA loop yang baru disintesis atau rantai template-nya.
Reaksi PCR untuk SSR dijalankan dengan primer forward dan reverse yang menempel pada ujung 5 `dan 3` dari masing-masing template DNA.
Fragmen PCR biasanya dipisahkan pada gel poliakrilamida yang dikombinasikan dengan pewarnaan AgNO3, autoradiografi atau sistem deteksi fluoresens. Agarose
gel biasanya 3 dengan EtBr juga dapat digunakan ketika perbedaan ukuran alel antara sampel lebih besar dari 10 bp. Namun penggunaan SSR dibatasi oleh
lambatnya data yang dihasilkan dan terbataskan pasangan marka serta dibutuhkannya biaya yang tinggi untuk melakukan pengembangan marka. Namun
demikian, perbaikan dibidang teknologi molekular terus dikembangkan seperti adanya metoda multiplex PCR untuk amplifikasi DNA.
Multipleks PCR yaitu metoda PCR yang menggunakan beberapa marka dalam satu reaksi. Metoda ini bertujuan meningkatkan jumlah informasi dari yang
diperoleh per reaksi, dan untuk mengurangi pemakaian bahan dan biaya tenaga kerja. Kombinasi penggunaan bahan yang berbasis fluorescen berpendar mampu
secara otomasis mendeteksi DNA dan ukuran fragment sehingga mampu mempercepat proses, hasil yang lebih akurat dan perolehan data dengan biaya
yang lebih murah Mitchell et al.1997. Namun pengembangan multiplex PCR pada tanaman seringkali mengalami kesulitan karena besarnya ukuran genom dan
polyploidy. Namun saat ini telah dikembangkan metoda baru yang dikenal dengan metoda “Multiplex ready PCR” yang dikembangkan oleh Hayden et al. 2008
yang menggabungkan teknologi berbasis fluorescens dengan penggunaan primer M-13 . Metoda ini menggunakan deteksi SSR yang berpendar dan analiser
fragmen DNA otomatis untuk mengukur ukuran alel yang merupakan metoda analisis genotipe SSR yang paling cepat dan akurat Ziegle et al. 1992. Prosedur
ini berdasarkan pemisahan SSR yang berlabel oleh gel elektroforesis. Keuntungkan dari SSR yang berpendar adalah SSR dapat dipisahkan dalam gel
kapiler berdasarkan ukuran fragmennya tanpa tumpang tindih satu sama lain. Pada kasus saat SSR memiliki ukuran alel yang sama akan terjadi tumpang tindih,
maka pemisahan dapat dilakukan dengan melabel produk SSR dengan dye berpendar yang memiliki emisi panjang gelombang yang berbeda. Sehingga
keuntungan dari multiplex ready PCR yaitu kemampuannya menggunakan banyak marka dalam satu reaksi dan dapat dibedakan secara akurat melalui pendaran yang
memiliki panjang gelombang yang berbeda.
