53 Penelitian ini bertujuan untuk melihat sejauh mana keragaman genetik yang
dimiliki antar tetua dan keturunannya, serta melihat tingkat kemurnian dari persilangan yang dihasilkan berdasarkan kebenaran persilangan antar tetua.
5.2Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan pada bulan April 2014 sampai April 2015 di Laboratorium Bioteknologi, PT.Astra Agro Lestari Tbk., Pangkalan Bun,
Kalimantan Tengah. Sampel daun dikoleksi dari area pembibitan dan lahan percobaan PT. Astra Agro Lestari di Pangkalan Bun, Kalimantan Tengah. Total
136 individu dari 5 populasi telah dievaluasi.Populasi terdiri dari dua populasi D x D , dua populasi T x T, dan satu populasi persilangan D x P. Table 18. Jumlah
individu per populasi yang dievaluasi berkisar 20 hingga 37 individu per populasi. Total individu yang dievaluasi sebanyak 136 individu. Jaringan tanaman diambil
dari daun tombak pada tanaman dibibitan dan dilapangan.
Tabel 18. Daftar populasi kelapa sawit yang dievaluasi dalam penelitian
No Type
Family Name
Female Male
No Individual
Progeny Grand Parent
Progeny Grand Parent
1 TxT
Cross B01
LM16844 LM2T
LM16844 LM2T
20 2
TxT Cross
B02 LM19029
LM2T LM19029
LM2T 36
3 DxP
C72 LM18565
DA115 Self LM18978
LM2T x LM2T 37
4 Dura
Self A140
PO6690 DA115D x DA3D
PO6690 DA115D x DA3D
23 5
Dura Self
A125 PO6729
DA10D x DA115D PO6729
DA10D x DA115D 20
136
5.2.1 Bahan Kimia
Bahan kimia yang digunakan yaitu Genomic DNA Mini Kit Geneaid, ddH
2
0, Agarose, buffer GPX1, buffer GP3, buffer W1, buffer Wash, TAE 1x, loading dye, Bromfenol biru, elution buffer, KAPA 2G Fast Ready Mix, nuclease
free water, primer forward, primer reverse, label Fluorescent FAM, HEX,ROX, TAMRA.
5.2.2 Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan alat Tissue lyser menggunakan prosedur dari Geneaid kit. Sampel daun kelapa sawit kering
sebanyak 100 mg ditambah dengan 400 µl buffer GPX1. Selanjutnya dimasukkan ke dalam collection tube . Sampel yang telah berada di collection tube setelah
diberi bead bola besi dimasukkan ke dalam tissue lyser dan dikocok didalam tissue lyser dengan frekuesi 30 Hz selama 5 menit.
Selanjutnya dilakukan inkubasi tabung berisi sampel ke dalam waterbath suhu 60
C selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 100 µl buffer GP2 dan dicampur dengan di vortex. Tabung didinginkan di dalam kulkas -20
C selama 3 menit. Selanjutnya seluruh campuran sampel dipindahkan ke dalam tabung filter
54 colum dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 1000 g. Supernatan
dipindahkan ke mikrotube 1.5 ml tanpa menyentuh pelet yang terbentuk. Kemudian ditambahkan 1.5 kali buffer GP3 600 µl. Mencampurkan larutan
dengan dibolak balik dan divortex.
Selanjutnya 600 µl campuran dipindahkan ke dalam kolom GD. Campuran kemudian disentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 2 menit. Supernatan yang
terbentuk dibuang. Kemudian ditambahkan buffer W1 sebanyak 400 µl. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 1 menit. supernatan
yang terbentuk dibuang kembali. Selanjutnya ditambahkan buffer Wash sebanyak 600 µl. Campuran disentrifugasi kembali, dan supernatan yang terbentukdibuang
kembali. Selanjutnya dilakukan sentifugasi pada kecepatan 14.000 g selama 3 menit.
Kolom GD dipindahkan ke mikrotube 1.5 ml yang baru. Selanjutnya ditambahkan 50 µl elution buffer yang telah dipanaskan pada 60
C tepat ditengah kolom. Kemudian didiamkan kolom selama 5 menit. Dan dilakukan sentrifugasi
kembali 14.000 g selama 1 menit. Sample disimpan pada suhu -20 C.
5.2.3 Primer yang Digunakan
Primer yang digunakan dalam penelitian ini merupakan primer yang bersumber dari TropGene Cirad
Tabel 2.
5.2.4 Analisis Kuantifikasi dan Kualitifikasi DNA
Analisis kuantifikasi dan kualifikasi dilakukan dengan menggunakan alat Nano Drop 2000 spectrophotometer yaitu dengan mengukur absorbansi DNA
pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Penentuan kualitas DNA dapat dilakukan dengan menghitung rasio absorbansi pada A260 dengan A280. Nilai
rasio yang mendekati 2 menunjukkan tingkat kemurnian yang tinggi. Namun semakin rendah nilai rasio tersebut maka semakin rendah kualitas DNA akibat
adanya kontaminasi protein.
Penentuan kualitas juga dilakukan menggunakan metode elektroforesis. Pita DNA genom yang memiliki kualitas yang baik akan tampak sebagai pendar
tak putus pada gel agaros setelah proses elektroforesis. Gel yang digunakan adalah gel agarosa dengan konsentrasi 1 1 gram agarosa dalam 100 mL TAE 1x
0.04M Tris Asetat; 0.001M EDTA.
Genom DNA hasil isolasi sebanyak 5 µL dicampur dengan 1 µL loading dye [0.25 wv Bromfenol biru, 30 wv sukrosa dalam air]. Campuran
tersebut dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel elektroforesis yang direndam TAE 1X dalam chamber elektroforesis Mupid ®-exU, Advance. Proses
elektroforesis dilakukan selama 30 menit dengan tegangan 100 Volt.
Gel hasil elektroforesis dimasukkan kedalam etidium bromide selama 5 sampai 10 menit kemudian dibilas dengan akuades. Hasil pewarnaan kemudian
diamati menggunakan
UV Transilluminator
Major Science
dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera.
5.2.5 Amplifikasi PCR
Pencampuran PCR master Mix dan primer dilakukan menggunakan mesin Qiagility yang bekerja secara robotik mencampur komponen PCR seperti Buffer,
dNTP, MgCl2, dan DNA polymerase. Dalam percobaan ini 7.5 µl KAPA 2G Fast
