Ekstraksi Senyawa Flavonoid dari Sayuran Indigenous Hertog et Analisis Flavonoid dengan HPLC

2. Analisis Total Fenol Shetty

et al., 1995 yang dikutip oleh Ishartani, 2004 Penentuan total fenol bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel kering beku bubuk mula-mula diambil sebanyak 50.0 mg dan dilarutkan dalam 2.5 etanol 95, kemudian divorteks. Setelah itu dilakukan sentrifuse terhadap campuran tersebut selama 5 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0.50 ml etanol 95, 2.5 ml aquades, dan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteu 50. Campuran tersebut didiamkan dahulu selama 5 menit, lalu ditambahkan 0.5 ml Na 2 CO 3 5 dan divorteks. Setelah itu, sampel disimpan dalam ruang gelap selama satu jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm. Prosedur penentuan total fenol dapat dilihat secar ringkas pada gambar 20. Standar yang digunakan dalam penentuan total fenol adalah asam galat. Standar asam galat dibuat dengan variasi konsentrasi antara 50 – 250 mgL.

3. Analisis dan Identifikasi Flavonoid

a. Ekstraksi Senyawa Flavonoid dari Sayuran Indigenous Hertog et

al., 1992a Tahap ekstraksi sampel diawali dengan pelarutan sebanyak 0.500 atau 1.000 gram sampel kering beku ke dalam 40 ml metanol 62,5. Kemudian ditambahkan 10 ml HCl 6M lalu direfluks selama satu jam pada suhu 50 o C. tujuan penambahan asam ini adalah untuk menjaga komponen agar tidak terdegradasi dan perefluksan untuk hidrolisis asam guna memotong gula. Gula yang menempel pada flavonoid dapat mengganggu pemisahan komponen, sehingga ikatan tersebut perlu dipotong. Setelah didinginkan ditambahkan kembali metanol sampai volume larutan menjadi 100 ml. sebanyak dua milliliter larutan disaring dengan filter Syringe berdiameter 0.45 µm, dan sampel tersebut telah siap untuk diinjeksikan ke kolom HPLC. Proses pembuatan ekstrak sampel secara ringkas ditunjukkan pada gambar 21.

b. Analisis Flavonoid dengan HPLC

a. Pembuatan larutan Standar Tunggal Hertog et al., 1992a Sebanyak 1.5 mg standar yang tersedia dilarutkan dalam 3 ml metanol 62.5, sehingga diperoleh standar stock dengan konsentrasi 500 µgml. Setelah itu, 2.5 ml dari standar stock dilarutkan dalam 20 ml metanol 62.5. Kemudian dicampurkan dengan 5 ml HCl 6M untuk menjaga kondisi asamnya supaya komponen flavonoid tersebut tidak terdegradasi. Penambahan metanol dilakukan hingga volume mencapai 50 ml, sehingga konsentrasi yang diperoleh adalah 25 µgml. larutan standar yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas lima konsentrasi, yaitu 0.5, 2.5, 10, 20, dan 25 µgml. pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 0.5, 2.5, 10, 20 µgml dilakukan dengan melakukan pengenceran dari larutan standar yang memilik konsentrasi 25 µgml. Proses pembuatan larutan standar yang dibutuhkan pada penelitian ini dapat dilihat secara ringkas pada gambar 22. b. Pembuatan kurva standar Larutan standar sengan berbagai konsentrasi tersebut diinjeksikan ke kolom HPLC C-18 phase; Develosil ODS-UG-3 yang meiliki dimensi panjang 75 mm dan diameter dalam 4.6 mm. Fase gerak yang digunakan adalah 25 acetonitril di dalam KH 2 PO 4 0.025 M, dengan laju aliran 0,9 mlmenit. Diinjeksikan pula larutan standar campuran pada berbagai konsentrasi. Hasil dari kromatogram standar pada berbagai konsentrasi tersebut kemudian dimasukkan ke dalam satu grafik. Dari data-data masing-masing, dibuat persamaan garis yang akan digunakan pada perhitungan Limit of detection masing-masing standar. Dari data-data kromatogram standar campuran, dibuat persamaan garis yang digunakan pada perhitungan komponen flavonoid pada sampel. c. Perhitungan limit deteksi Rounds dan Nielsen, 2000 Limit of detection LOD atau limit deteksi diperoleh dengan cara menginjeksikan masing-masing standar sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi yang digunakan untuk menentukan LOD adalah konsentrasi yang terendah. Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut, dimasukkan kedalam persamaan kurva standar masing-masing, sehingga diperoleh konsentrasi dan standar deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga kali dari nilai standar deviasi. d. Pembuatan larutan dan kurva standar campuran Proses pembuatan larutan standar campuran pada penelitian ini sama dengan proses pembuatan larutan standar tunggal. Hanya saja pada standar campuran ini dibuat dengan cara mencampur kelima standar yang ada dengan perbandingan volume 1:1 dimana konsentrasi apigenin dibuat menjadi dua kali konsentrasi standar lainnya. Penentuan variasi konsentrasi yang digunakan ditentukan dengan memperhatikan nilai limit deteksi masing-masing standar. e. Injeksi ekstrak sampel ke kolom HPLC Hertog et al., 1992a Ekstrak sampel yang telah disaring dengan Syringe filter 0.45 µm, diinjeksikan ke kolom HPLC C-18 phase; Develosil ODS-UG-3 yang memiliki dimensi panjang 75 mm dan diameter dalam 4.6 mm. Fase gerak yang digunakan adalah 25 acetonitril di dalam KH 2 PO 4 0.025 M, dengan laju aliran0,9 mlmenit. f. Pembuatan ko-kromatogram Pembuatan ko-kromatogram dilakukan dilakukan dengan cara mencampur ekstrak sampel dengan kelima standar yang digunakan sebagai acuan identifikasi dengan perbandingan 1:1. Pada pembuatan ko-kromatogaram ini campuran standar yang digunakan adalah campuran standar dengan konsentrasi tertinggi 4.17 µgml untuk standar myricetin, luteolin, quercetin, dan kaempferol serta 8.33 µgml untuk standar apigenin. Larutan campuran sampel dan standar diinjeksikan sebanyak 20 µL dan direkam luas areanya. Penentuan peak standar pada ko-kromatogram dilakukan dengan membandingkan urutan peak yang terbentuk dan luas area ko-kromatogram dengan kromatogram sampel. Peak pada ko-kromatogram yang memiliki luas area yang berbeda lebih besar dengan peak pada kromatogram sampel merupakan peak jenis flavonoid yang ditambahkan. Selanjutnya penentuan kandungan flavonoid pada kromatogram sampel dilakukan dengan membandingkan kromatogram sampel tersebut dengan ko-kromatogram sampel sesuai urutan peak yang terbentuk pada masing-masing waktu retensinya. g. Identifikasi flavonoid pada sampel Hasil dari kromatogram sampel kemudian dibandingkan dengan kromatogram standar. Penentuan komponen yang terdapat pada sampel dilihat berdasarkan waktu retensi masing-masing standar. Dari area yang diperoleh, dihitung konsentrasinya dengan menggunakan persamaan garis dari kurva standar campuranyang sudah diperoleh. Selain itu dilakukan pula perhitungan dengan menggunakan eksternal standar, yaitu dengan membandingkan luas area komponen pada sampel dengan luas area pada standar campuran. Standar campuran yang digunakan sebagai eksternal standar adalah standar campuran dengan konsentrasi yang tertinggi.

4. Analisis Data