Apigenin adalah senyawa lainnya dari golongan flavone yang akan diidentifikasi pada penelitian ini. Apigenin merupakan aglikon dari apiin, yang
diisolasi dari daun tanaman peterseli dan seledri. Senyawa ini berbentuk padatan dan berwarna kuning, dan sering digunakan untuk pencelupan bulu
domba Anonim, 2008. Senyawa apigenin memiliki kemampuan antara lain sebagai zat anti perdangan, antibakteri, dan untuk mengatasi masalah lambung
Cadenas danPacker, 2002. Perbedaan antara senyawa flavonol dan flavone dapat dilihat secara lebih jelas pada Gambar 17.
Senyawa R1 R2 R3
Flavonol yang diidentifikasi
Myricetin OH OH OH Quercetin OH OH H
Kaempferol OH H H
Flavone yang diidentifikasi
Luteolin H OH H
Apigenin H H H Gambar 17. Struktur kimia Flavonol dan flavone yang diidentifikasi
C. IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID
Analisis kimia dengan metode kromatografi didasarkan pada pemisahan komponen yang terpartisi diantara dua fase dalam suatu kesetimbangan dinamis
dan mengalir. Proses ini dilakukan dengan menggerakkan suatu fase secara mekanis fase gerak, relatif terhadap fase lainnya.
Menurut Gritter et al., 1991, secara teori pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan
sebesar-besarnya, sehingga memastikan kesetimbangan yang baik antara fase. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak harus bergerak
dengan cepat sehingga difusi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, pada sebagian besar system kromatografi digunakan
penjerap atau penyangga berupa serbuk halus. Untuk memaksa fase gerak bergerak lebih cepat melalui fase diam yang terbagi pada serbuk halus, harus
digunakan tekanan tinggi. Dengan dipenuhinya kedua persayaratan tersebut,
diperoleh teknik kromatografi cair yang paling kuat yakni HPLC High Performance Liquid Chromatography. Jadi pada HPLC fase gerak dialirkan
dengan cepat dan hasilnya dideteksi dengan instrumen. Komponen utama dari system HPLC adalah pompa tekanan tetap dan
volume tetap, penginjeksi, kolom ekternal dan internal, detektor, dan rekorder atau sistem data yang terintegrasi Rounds dan Gregor, 2003.
Parameter-parameter yang akan mempengaruhi system kerja pada HPLC antara lain diameter dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran lubang pada fase diam,
dan tekanan pompa. Terdapat lima tipe HPLC yaitu normal phase chromatography, reversed
phase chromatography, ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography, dan affinity chromatography Rounds dan Gregor, 2003.
Pada penilitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase chromatography RP-HPLC. Fase diam dari HPLC jenis ini adalah senyawa
nonpolar, sedangkan pase geraknya polar. Karena hal tersebutlah maka komponen yang akan kelur dahulu adalah komponen yang polar dibandingkan
yang nonpolar. Lebih dari 70 teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan
tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang menggunakan metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian,
analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan karbohidrat, dan penentuan unsur-unsur pokok dari miniman ringan. Reversed phase HPLC
dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk menganalisis lemak Rounds dan Gregor, 2003.
Antioksidan, seperti butylated hydroxylanisole BHA dan butylated
hydroxytoluene BHT, dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis dengan menggunakan detector UV dan fluoresens secara bersamaan. Bahan
pangan basah, pigmen seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin, dan komponen fenolik seperti vanili dapat pula dianalisis dengan menggunakan
metode RP-HPLC Rounds dan Gregor, 2003. Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak
dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom
RP-HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan larutan basa karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika. Kolom
RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asam tapi tetapi tidak boleh kontak terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada
dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga agar tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan komponen.
Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam kolom HPLC adalah dengan menginjeksikan campuran dari 2,2’- dan 4,4’-bipiridin. Bila
terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa 2,2’-bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan diidentifikasi
menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil yang tidak sesuai. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen fenolik
dalam bahan pangan dengan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan memberikan
penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Flavonoid yang merupakan bagian dari senyawa fenolik, memiliki serapan pada panjang
gelombang antara 240 dan 270 nm, dan antara 320 dan 380 nm. Untuk itulah, pada deteksi komponen fenolik, detektor yang digunakan pada komponen
HPLC adalah detektorUV atau UV-Vis Lee, 2000. Fase gerak yang biasa digunakan dalam identifikasi senyawa fenolik
dengan HPLC adalah metanol, acetonitril, dan tetrahidrofuran. Penggunaan tetrahidrofuran sebagai fase gerak dalam sistem HPLC, memberikan hasil
pemisahan yang terbaik diikuti oleh acetonitril, dan terakhir metanol. Namun, pada identifikasi senyawa flavonoid, fase gerak yang biasa digunakan adalah
metanol dan acetonitril. Tetrahidrofuran akan memberikan hasil yang sangat signifikan berbeda bila digunakan untuk mengidentifikasi asam sinamat dalam
jus jeruk Lee, 2000. Analisis flavonoid pada sayuran seperti yang dikemukakan Hertog et al.,
a 1992 banyak diadopsi oleh para peneliti-peneliti lain Lee, 2000. Identifikasi flavonoid pada sayuran dilakukan dengan menggunakan fase gerak
25 acetonitril dalam buffer fosfat 0.025M. laju alirannya adalah 0.9 mlmenit. Sampel yang akan diidentifikasi akan melewati kolom Nova-Pak C18, yang
memiliki dimensi 150 x 3.9-mm ID. Detektor yang digunakan yaitu Linear Model 204 UV-Vis detector Hertog et al., a 1992.
Menurut Macrae 1988, keuntungan utama dari HPLC adalah kemampuannya untuk menangkap komponen dengan stabilitas panas yang
terbatas ataupun yang bersifat volatil. HPLC merupakan metode yang sangat sensitif, tepat, selektif, dan memiliki tingkat otomatisasi yang tinggi, sehingga
lebih sederhana dalam pengoperasiannya. Di samping itu, HPLC banyak digunakan untuk analisis karena kemudahan injeksi, deteksi dan pengolahan
data serta dapat digunakan untuk berbagai macam sampel seperti sampel cairan, padatan yang dilarutkan, maupun sampel yang labil terhadap pemanasan.
Modern HPLC telah banyak diaplikasikan seperti pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan penghitungan komponen yang bervariasi.
Menurut Adamson et al., 1999 HPLC merupakan metode yang efektif untuk mendeteksi dan menghitung komponen fenol dan metode ini telah
digunakan secara luas. HPLC telah digunakan dalam menghitung prosianidin dalam kakao dan coklat.
Dalam penelitian lain Mark et al., 2005 mengungkapkan bahwa HPLC merupakan metode yang telah banyak digunakan untuk analisis kuantitatif
senyawa polifenol seperti flavonol dan proantosianidin.
III. BAHAN DAN METODE
A. BAHAN DAN ALAT I. Bahan
Bahan-bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah bahan untuk analisis bahan untuk membuat larutan standar, dan bahan
untuk membuat ekstrak sayuran. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan larutan standar adalah myricetin, luteolin, quercetin, apigenin,
dan kaemferol Sigma Aldrich, metanol 62.5, dan HCl 6M. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan ekstrak sayuran adalah daun kelor
Moringa pterygosperma Gaertn., buah takokak Solanum torvum.Swartz seluruh bagian tanaman antanan beurit Hydrocotyle sibthorpioides Lmk,
bunga pepaya Carica papaya.L, daun jambu mete Anacardium occidentale. L, dan daun mengkudu Morinda citrifolia.L, yang diperoleh
dari BALITRO Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik Bogor. Daun labu siam Sechium edule Jacq. Swartz., daun kacang
panjanglembayung Vigna unguiculata L. Walp, daun pakis Arcypteris
irregularis C.Presl Ching, dan kucai Allium schoenoprasum L., yang
diperoleh dari pasar-pasar lokal yang berada di daerah Bogor. Daun mangkokan putih Nothopanax scutellarium Burm.f. Fosb,, dan bunga
turi Sesbania grandiflora L. Pers., diperoleh dari Kebun Pusat Studi Biofarmaka Kampus IPB Darmaga. Bunga terubuk Saccharum
edule.Hassk, diperoleh dari petani-petani di daerah Bogor Liuk, Leuwiliang. Metanol 62.5, dan HCl 6M. Bahan-bahan yang digunakan
untuk analisis flavonoid adalah acetonitril, KH
2
PO
4
, water chromatography, Folin Ciocalteu, Na
2
CO
3
, dan etanol 95.
II. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat untuk membuat larutan standar, ekstrak sayuran, dan analisis. Untuk pembuatan
larutan standar alat-alat yang digunakan adalah labu takar, gelas ukur, pipet mohr, pipet tetes, dan spatula. Alat-alat yang digunakan untuk membuat