2. Standar Campuran Senyawa Flavonoid
Dalam suatu bahan pangan, senyawa flavonoid tidak pernah terdapat secara mandiri. Adanya senyawa lain baik itu sesama flavonoid atau bukan
akan mempengaruhi senyawa yang dimaksud. Termasuk juga di dalam perbedaan waktu retensi antara masing-masing senyawa dalam campuran jika
dibandingkan bila senyawa tersebut berdiri sendiri. Oleh karena itu, diperlukan pembuatan standar campuran untuk menentukan waktu retensi yang diharapkan
akan lebih dekat dengan waktu retensi flavonoid pada sampel. Pembuatan standar campuran dilakukan dengan mencampur semua
standar yang digunakan dengan perbandingan 1:1 pada masing-masing tingkat konsentrasi yang sama. Konsentrasi yang dibuat pada standar campuran adalah
0.83-1.67-2.5-3.33-4.17 µgml untuk senyawa myricetin, luteolin, quercetin, dan kaempferol, sedangkan untuk senyawa apigenin , konsentrasi yang dibuat
adalah1.67-3.33-5-6.67-8.33 µgml. Pembuatan konsentrasi apigenin yang menjadi dua kali konsentrasi senyawa lainnya dikarenakan respon dari apigenin
yang sangat rendah jika dibandingkan dengan keempat senyawa lainnya. Hal ini dapat diketahui dari nilai limit deteksi apigenin yang cukup besar dibandingkan
keempat senyawa lainnya. Penentuan besarnya tingkat konsentrasi yang digunakan pada standar
campuran ini mengacu pada nilai limit deteksi dari masing-masing standar. Nilai limit deteksi ini menjelaskan bahwa batas minimal konsentrasi yang masih dapat
dideteksi oleh instrumen yang digunakan. Dari nilai-nilai tersebut dibuatlah variasi konsentrasi standar campuran tersebut. Sebagai contoh, limit deteksi
terendah dari kelima standar adalah quarcetin 0.028 µgml. Untuk itu variasi konsentrasi terendah yang dibuat untuk kelima standar tersebut adalah 0.83
µgml kecuali apigenin 1.67 µgml. Nilai ini masih berada dalam batas minimal respon standar yang artinya pada konsentrasi tersebut senyawa standar yang
diinjeksikan pasti dapat teridentifikasi. Untuk standar apigenin, konsentrasi terendahnya dibuat menjadi dua kali lipat dari keempat standar lainnya yaitu
1.67 µgml. Hal ini dilakukan untuk menyeragamkan hasil penginjeksian standar tunggal dimana senyawa apigenin tersebut baru dapat terdeteksi apabila
konsentrasinya dinaikkan menjadi dua kali konsentrasi terendah dari keempat
standar lainnya. Selain itu dengan variasi konsentrasi standar campuran seperti itu dapat menghemat biaya, disamping itu hasil analisa yang dihasilkan akan
lebih baik dan efisien terutama dari peak-peak yang dihasilkan karena tentunya dengan konsentrasi yang lebih besar pastinya peak dan luas areanya akan
semakin besar juga. Dari hasil penginjeksian kelima konsentrasi campuran tersebut, ternyata ada
hal yang menarik untuk diketahui. Diantara semua standar yang diinjeksikan bila dibandingkan dengan hasil penginjeksian standar dalam bentuk tunggal
terlihat luas area yang dihasilkan pada konsentrasi 2.5 µgml myricetin, quarcetin, dan kaempferol, 5 µgml apigenin hasil penginjekasin standar
campuran ini mengalami peningkatan luas area. Kecuali luteolin justru mengalami penurunan luas area. Hal ini terjadi karena dari kromatogram standar
campuran yang dihasilkan terlihat bahwa peak yang terbentuk pada waktu retensi luteolin dan quarcetin hampir sama bahkan saling menyatu. Hal ini
memungkinkan terjadinya interaksi antara kedua senyawa tersebut sehingga terjadi pengurangan konsentrasi pada satu senyawa di sisi lain terjadi
peningkatan konsentrasi pada senyawa yang satunya yang saling berinteraksi dalam hal ini diduga sebagian senyawa luteolin terserap atau menjadi bagian
dari senyawa quarcetin sehingga luas area dari luteolin pun berkurang. Hasil penginjeksian kelima konsentrasi campuran tersebut, dibuatlah kurva
standar campuran dengan persamaan garis untuk masing-masing senyawa flavonoid yang digunakan dalam perhitungan konsentrasi flavonol dan flavone
yang terdapat di dalam sampel. Contoh kromatogram standar campuran dapat dilihat pada Gambar 27. yang menggunakan konsentrasi campuran yang
tertinggi 4.17 untuk myricetin, luteolin, quarcetin dan kaempferol serta 8.33 untuk apigenin.
Persamaan garis untuk myricetin adalah y = 171915 x - 76058, dengan nilai r
2
= 0.999. Kurva standar campuran myricetin dapat dilihat pada Gambar 28. Persamaan garis untuk luteolin adalah y = 20332 x - 5779, dengan nilai r
2
= 0.998. Kurva standar campuran luteolin dapat dilihat pada Gambar 29.
Persamaan garis untuk quercetin adalah y = 77985 x - 16728, dengan nilai r
2
= 0.998. Kurva standar campuran quercetin dapat dilihat pada Gambar 30.
Persamaan garis untuk apigenin adalah y = 54005 x - 49812, dengan nilai r
2
= 0.998. Kurva standar campuran apigenin dapat dilihat pada Gambar 31.
Persamaan garis untuk kaempferol adalah y = 183312 x - 85155, dengan nilai r
2
= 0.998. Kurva standar campuran kaempferol dapat dilihat pada Gambar 32.
Tabel 5 . Hasil penginjeksian standar flavonoid dalam bentuk campuran
Standar Flavonoid
Rtwaktu retensi menit ke-
Persamaan kurva standar
Limit deteksi LOD
Myricetin 4.1
- 5.3
y =
171915x -
76058 0.039 0.026 Luteolin
8.4 -
8.7 y
= 20332x
- 5779
0.056 0.038 Quarcetin
8.6 -
9.8 y
= 77985x
- 16728 0.028 0.022
Apigenin 15.1
- 17.3
y =
54005x -
49812 0.22 0.19 Kaempferol
17.6 –
20.2 y
= 183312x
- 85155 0.047 0.037
limit deteksi LOD dari standar yang dianalisa Batari, 2007 pada instrumen sfesifikasi HPLC yang berbeda tapi dengan jenis kolom yang sama.
Gambar 27.
Kromatogram standar campuran
konsentrasi µgml
area mAU
0.83 67525 1.67 217408
2.5 344943 3.33 491388
4.17 647387
Gambar 28 . Kurva standar campuran myricetin
konsentrasi µgml
area mAU
0.83 10602 1.67 29794
2.5 43950 3.33 61267
4.17 79645
Gambar 29 . Kurva standar campuran luteolin
konsentrasi µgml
area mAU
0.83 45729 1.67 113686
2.5 180248 3.33 247464
4.17 304052
Gambar 30 . Kurva standar campuran quercetin
konsentrasi µgml
area mAU
1.67 45844 3.33 125283
5 219199 6.67 304784
8.33 405957
Gambar 31 . Kurva standar campuran apigenin
Gambar 32 . Kurva standar campuran kaempferol
C. TOTAL FENOL