aktivitas peroksidase endogen. Sediaan direndam dalam milique, lalu PBS masing-masing 2 kali selama 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi dengan serum
normal BSA 10 60-70 lsediaan dan diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 35 menit lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Selanjutnya sediaan dilingkari
dengan dako pen dan ditetesi
biocare’s background sniper sebagai blocking
protein dan disimpan pada suhu 37
o
C selama 30 menit,
lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Berikutnya, sediaan ditetesi dengan antibodi primer
monoklonal anti-insulin I-2018 dalam PBS 1:1000 sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 4
o
C refrigerator selama 24 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Selanjutnya, sediaan ditetesi dengan t
rekkie universal link
sebanyak 60-70 lsediaan lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi
trek avidin-HRP
sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 15 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Kemudian, sediaan
ditetesi dengan diaminobenzidine DAB sebanyak 60-70 lsediaan dan dibiarkan bereaksi dalam ruang gelap selama 3-5 menit. Sediaan dicuci dengan milique,
selanjutnya diwarnai counterstain dengan hematoksilin. Setelah dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70,80,90 dan 95, lalu alkohol absolut I, II
dan III dan penjenihan dengan xylol I,II dan III. Tahap akhir sediaan kemudian dimounting dengan penutup gelas dengan perekat entelan dan siap diamati di
bawah mikroskop cahaya pembesaran 200 dan 400 kali. Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada jaringan pankreas sel betainsulin yang jika positif
ditunjukkan dengan warna cokelat.
i. Mikrofotografi Pengamatan dan Pemotretan
Preparat-preparat yang
dihasilkan pada
pewarnaan HE
dan imunohistokimia diamati di bawah mikroskop cahaya dan didokumentasikan
dengan mikroskop foto Nikon E 6 000. Pengamatan yang dilakukan terhadap sediaan dengan pewarnaan HE adalah penghitungan jumlah pulau Langerhans.
Pengamatan terhadap sediaan dengan pewarnaan imunohistokimia adalah menghitung rata-rata jumlah sel beta pankreas buah yang dihitung dari 10 pulau
Langerhans per sediaan dengan mikroskop elektron transmisi. Semua gambaran histologi sel beta pankreas dilakukan pemotretan dengan pembesaran 20x.
3.3.5.2. Pengukuran aktivitas enzim katalase Rice-Evans et al. 1991
Persiapan sampel
Homogenat hati untuk analisis katalase, dibuat dengan cara 0.5 g hati ditambah dengan 1 ml buffer posfat pH 7.4 kemudian dicincang halus dan
disentrifugasi pada kecepatan 13 000 g, suhu 4
o
C selama 20 menit. Homogenat diambil untuk analisis aktivitas enzim katalase atau dapat disimpan pada suhu
-4
o
C untuk dianalisis kemudian. Selanjutnya, sebanyak 500 l homogenat hati dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan ditambahkan dengan 0.5 ml 0.5
Triton X-100, disentrifugasi pada 2 090 g, suhu 4
o
C selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk analisis aktivitas katalase.
Persiapan larutan standar dan pengukuran aktivitas katalase
Untuk pembuatan larutan standar, dibuat dari larutan induk 1 M H
2
O
2
dengan cara 10.2 ml H
2
O
2
30 kemudian diencerkan sampai volume 100 ml. Kemudian dibuat seri larutan standar H
2
O
2
dari larutan 1 M H
2
O
2
dengan konsentrasi 0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 dan 1 M. Pengukuran standar dilakukan
sebagai berikut. Masing-masing larutan standar dipipet 1 ml dimasukkan ke dalam tabung bersih. Tambahkan 2 ml larutan 5 K
2
Cr
2
O
7
kemudian dipanaskan di dalam air mendidih selama 10 menit, kemudian dinginkan. Hasil reaksi dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara mencampurkan 1 ml sampel
dalam 5 ml 0.05 M bufer fosfat pH 7 di dalam tabung uji dan dihomogenkan vortex, ditambahkan 2 ml 0.2M H
2
O
2
dan inkubasi selama 30 menit. Kemudian, 1 ml campuran di atas diambil dan ditambahkan dengan 2 ml larutan 5 K
2
Cr
2
O
7
dan dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit. Larutan didinginkan dan absorbansi dibaca pada panjang gelombang 570 nm.
3.3.5.3. Pengukuran aktivitas enzim superoksida dismutae SOD Nebot et
al. 1993 Persiapan sampel
Persiapan homogenat hati sama seperti pada metode analisis enzim katalase. Sebanyak 400
l larutan kloroformethanol dingin vvμ 37.562.5 dan 150 l homogenat dimasukan ke tabung ependorf, kemudian dihomogenkan
divortex selama 3 detik dan disentrifugasi pada kecepatan 2 090 g, suhu 4
o
C selama 10 menit. Supernatan diambil untuk dianalisis aktivitas SOD atau dapat
disimpan pada suhu -4
o
C untuk dianalisis kemudian.
Persiapan Larutan Standar
Larutan standar dibuat dengan melarutkan SOD murni menghasilkan beberapa konsentrasi larutan, yaitu 0; 50; 100; 200; 250; 300; dan 500 unitmg
protein. Seri larutan ini digunakan untuk membuat kurva standar.
Pengukuran aktivitas enzim SOD
Pengukuran aktivitas enzim ini berlangsung pada suhu 25
o
C, larutan xantin oksidase harus tetap dalam keadaan dingin didinginkan selama 15 menit
sebelum digunakan. Medium reaksi segera dipersiapkan sebelum pengukuran dengan memasukkan 2.9 ml larutan A campuran larutan xantin dan larutan
sitokrom c ke dalam tabung reaksi 3 ml. Selanjutnya ditambahkan 50 l larutan baku kontrol atau sampel dan divorteks perlahan-lahan. Reaksi dimulai dengan
menambahkan 50 l larutan B xantin oksidase dan divorteks secara perlahan. Absorbansi diukur dengan spektrofotometer pada 550 nm. Untuk blanko
digunakan buffer fosfat sebagai pengganti sampel dan sebagai kontrol digunakan air destilasi.
3.3.5.4. Pengukuran aktivitas enzim glutation peroksidase Pigeolet et al.
1990 Persiapan sampel
Persiapan homogenat hati sama seperti pada metode analisis enzim katalase
. Sebanyak 100 l homogenat hati ditambahkan dengan 200 l buffer fosfat pH 7 lalu dihomogenkan divortex. Homogenat disentrifugasi pada
kecepatan 2 090 g, suhu 4
o
C selama 5 menit. Supernatan diambil untuk diukur aktivitas enzim glutation peroksidase.
Pengukuran aktivitas enzim glutation peroksidase
Sebanyak 200 l 0.1 M buffer fosfat pH 7 mengandung 0.1 mM EDTA ditambahkan dengan 200 l enzim glutation reduktase 2.4 unit. Semua campuran
larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37
o
C. Selanjutnya ke dalam larutan ditambahkan 200 l 1.5 mM NADPH dan diinkubasi lagi pada suhu 37
o
C selama 3 menit, kemudian ditambahkan 200 l 1.5 mM H
2
O
2
. Absorbansi dibaca di antara waktu 1-2 menit pada panjang gelombang 340 nm.
Perhitungan mUnit GSH-Px =
Δ abs x Vt x 2 x 1000 x 1 6.22 x Vs mg protein
dimana, Δ abs : perubahan absorbansi
Vt : volume total dalam ml
Vs : volume sampel dalam ml
6.22 : koefisien ekstensik dari NADPH 2
: 2 mol GSH yang setara untuk mengoksidasi 1 mol NADPH 1000 : perubahan menjadi milli unit
3.3.6. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
RAL. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam ANOVA. Jika perlakuan memberikan pengaruh sangat nyata, maka pengujian dilanjutkan
dengan uji beda Duncan pada taraf 1 Steel Torrie 1993 untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan. Percobaan dapat diterangkan oleh model linier aditif.
Model linier untuk penelitian ini adalah: Y
ij
= + π
i
+ ε
ij
Keterangan: Y
ij
= Nilai parameter pengamatan dari perlakuan ke-i, pengamatan ke-j = Nilai tengah umum rata-rata sebenarnya
π
i
= Pengaruh perlakuan ke-i ε
ij
= Pengaruh galat percobaan pada perlakuan ke-i, pengamatan ke-j
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Karakterisasi, Preparasi dan Analisis Kimia Bahan Baku Teripang 4.1.1. Karakterisasi Teripang Pasir
Holothuria scabra J
Teripang yang digunakan dalam penelitian ini adalah teripang pasir Holothuria scabra J dengan umur berkisar antara 1-2 tahun. Morfologi umum
teripang pasir berbentuk bulat, panjang seperti ketimun, dengan punggung abu- abu atau kehitaman berbintik putih atau kuning, di seluruh permukaan tubuh
diselimuti lapisan kapur. Tubuh teripang kesat, berotot tebal dengan kulit berbintik-bintik. Secara lengkap bentuk teripang yang digunakan sebagai bahan
baku dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10 Bahan baku teripang pasir Holothuria scabra J. A = Tampak atas, B=Tampak bawah.
Panjang rata-rata teripang yang digunakan pada penelitian ini berkisar antara 20-35 cm dengan bobot antara 200-350 gekor. Teripang dewasa
mempunyai ciri-ciri antara lain tubuh panjang antara 25-35 cm dengan bobot 200- 500 gekor. Rata-rata usia teripang dewasa adalah 6.5-8 bulan Dewi 2008.
Sesuai dengan ciri-ciri tersebut maka teripang yang digunakan dalam penelitian ini merupakan teripang yang sudah dewasa.
4.1.2. Preparasi Bagian Tubuh Teripang Pasir
Tubuh teripang secara garis besar terbagi atas empat bagian utama yaitu daging, kulit, jeroan dan gonad, air dan kotoran. Daging merupakan bagian luar
A
B
