masuk ke seluruh bagian organ, dapat digantikan oleh parafin, dengan demikian jaringan mudah dipotong. Setelah tahapan perjernihan selesai jaringan berada
dalam xylol III, oven suhu 60
o
C, potongan jaringan dikeluarkan dari tissues cassete, lalu dimasukkan ke dalam parafin cair I, II, dan III berturut-turut selama 1
jam. Infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven suhu 60
o
C. Selanjutnya sampel dicetak dalam parafin.
f. Pencetakan
Pencetakan potongan jaringan pankreas dalam parafin, dilakukan dengan bantuan Tissue Embedding Console. Parafin cair dituangkan pada cetakan yang
telah diberi gliserin dan potongan-potongan pankreas diletakkan di dalam parafin. Posisi potongan pankreas diletakkan sedemikian rupa sehingga bagian potongan
yang rata dan lebar berada di dasar. Parafin didinginkan sampai membeku, lalu dilepaskan dari cetakan. Bagian parafin yang memuat potongan pankreas dipotong
menjadi bentuk segi empat, kemudian ditempelkan pada balok kayu. Sampel di atas balok kayu ini disimpan di dalam refrigerator minimal 1 jam sebelum
dipotong menggunakan mikrotom. Hal ini dilakukan agar dihasilkan pita jaringan yang baik.
g. Pemotongan
Pemotongan dilakukan menggunakan mikrotom, agar dihasilkan pita jaringan dengan ketebalan sekitar 5 m. Sebelum pemotongan jaringan dengan
ketebalan 5 m, terlebih dahulu dilakukan trimming parafin dengan ketebalan sekitar 10 m hingga diperoleh pita jaringan yang baik. Jika telah diperoleh pita
yang baik, hasil sayatan diapungkan di atas aquades dingin. Sayatan yang bagus diambil dan dibentangkan di atas aquades hangat 45
o
C, lalu ditempelkan pada gelas obyek dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37
o
C. Sampel siap untuk diwarnai.
h. Pewarnaan Hematoksilin-Eosin dan Imunohistokimia
Dua macam pewarnaan dilakukan dalam tahapan ini yaitu pewarnaan HE dan pewarnaan dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan HE dilakukan untuk
pengamatan terhadap struktur umum jaringan. Pewarnaan imunohistokimia dalam
penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi sel beta pankreas, yaitu sel penghasil insulin.
Pewarnaan HE
Tahapan pewarnaan dimulai dengan deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan xylol III, II, dan I, dengan maksud untuk
melarutkan parafin dari jaringan. Tahap berikutnya ialah rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol alkohol absolut III, II, dan I, alkohol
95, 90, 80 dan 70. Kemudian sediaan dimasukkan ke dalam milique sebagai stopping point. Sediaan kemudian diwarnai dengan pewarna hematoksilin dan
kembali disiram dengan milique untuk menguatkan warna hematoksilin, dilanjutkan dengan memasukkannya ke dalam aquades. Sediaan kemudian diberi
pewarna eosin, selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan mencelupkan sediaan ke dalam serial larutan alkohol 70, 80, 90, dan 95, alkohol absolut I, II,
III. Penjernihan dengan xylol I, xylol II dan xylol III. Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu penempelan gelas penutup pada sediaan dengan perekat
entelan. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati dengan mikroskop cahaya dengan pembesaran 200 dan 400 kali. Pengamatan yang dilakukan adalah
terhadap struktur umum jaringan normal maupun yang telah mengalami perubahan dengan melihat jumlah dan luas pulau Langerhans.
Pewarnaan Imunohistokimia terhadap Sel Beta Pankreas Wresdiyati 2008
Pewarnaan imunohistokimia dilakukan untuk mendeteksi hormon insulin yang dihasilkan oleh sel beta pankreas. Tahapan pewarnaan imunohistokimia
dimulai dari pembuatan sediaan histologi seperti yang telah diuraikan dalam pembuatan sediaan histologi, hanya saja gelas obyek yang digunakan untuk
menaruh sediaan adalah gelas obyek yang sudah diberi perekat neofren. Tahapan selanjutnya, preparat histologi yang telah dibuat dilakukan pewarnaan
imunohistokimia terhadap insulin menggunakan metode tidak langsung dua tahap metode antibodi berlabel enzim. Setelah deparafinasi dan rehidrasi, sediaan
direndam dalam air milique sebagai stopping point. Selanjutnya sediaan direndam dengan H
2
O
2
dalam metanol 1:20 selama 15 menit untuk menghilangkan
aktivitas peroksidase endogen. Sediaan direndam dalam milique, lalu PBS masing-masing 2 kali selama 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi dengan serum
normal BSA 10 60-70 lsediaan dan diinkubasi pada suhu 37
o
C, selama 35 menit lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Selanjutnya sediaan dilingkari
dengan dako pen dan ditetesi
biocare’s background sniper sebagai blocking
protein dan disimpan pada suhu 37
o
C selama 30 menit,
lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Berikutnya, sediaan ditetesi dengan antibodi primer
monoklonal anti-insulin I-2018 dalam PBS 1:1000 sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 4
o
C refrigerator selama 24 jam, kemudian dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Selanjutnya, sediaan ditetesi dengan t
rekkie universal link
sebanyak 60-70 lsediaan lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Kemudian, sediaan ditetesi
trek avidin-HRP
sebanyak 60-70 l per sediaan lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 15 menit, lalu dicuci dengan PBS 3 kali 5 menit. Kemudian, sediaan
ditetesi dengan diaminobenzidine DAB sebanyak 60-70 lsediaan dan dibiarkan bereaksi dalam ruang gelap selama 3-5 menit. Sediaan dicuci dengan milique,
selanjutnya diwarnai counterstain dengan hematoksilin. Setelah dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70,80,90 dan 95, lalu alkohol absolut I, II
dan III dan penjenihan dengan xylol I,II dan III. Tahap akhir sediaan kemudian dimounting dengan penutup gelas dengan perekat entelan dan siap diamati di
bawah mikroskop cahaya pembesaran 200 dan 400 kali. Pengamatan secara kualitatif dilakukan pada jaringan pankreas sel betainsulin yang jika positif
ditunjukkan dengan warna cokelat.
i. Mikrofotografi Pengamatan dan Pemotretan
