UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4.8 Fermentasi
Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan menggunakan media PDY Potatoes Dextrose Yeast, yang bertujuan untuk memperoleh ekstrak yang
mengandung senyawa metabolit sekunder dari isolat kapang endofit. Koloni murni kapang endofit pada cawan petri PDA yang telah diinkubasi selama 7
hari, kemudian dengan menggunakan cork borer diambil 3 potongan berukuran 1 x 1 cm. Potongan kapang tersebut kemudian diinokulasikan ke dalam media
fermentasi cair PDY sebanyak 200 mL dalam botol kaca steril berukuran 500 mL.
Kapang endofit kemudian difermentasi goyang menggunakan rotary shaker dengan kecepatan 130 rpm, dilakukan pada suhu 37
℃ selama 14 hari. Setelah itu medium cair hasil fermentasi tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifus
ukuran 15 mL yang sebelumnya telah disterilisasi terlebih dahulu, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan hasil
sentrifugasi diambil.Supernatan ini kemudian digunakan untuk uji aktivitas antibakteri sebagai larutan uji Sinaga, 2009 ; Kumala, 2006 dengan modifikasi.
3.4.9 Uji Aktivitas Antibakteri
3.4.9.1 Identifikasi Bakteri Uji Identifikasi bakteri uji dilakukan secara makroskopik dan mikroskopik
pada bakteri uji yang berusia 18-24 jam. Identifikasi makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni.
Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan metode pewarnaan Gram. Gelas objek dibersihkan dahulu dengan kain bersih yang sudah dibasahi dengan
etanol 70, kemudian dilewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak dan biarkan dingin sebelum dipakai. Buat batas bulatan dengan pensil gelas. Buat
suspensi kuman dengan satu ose NaCl fisiologis atau akuades steril di atas gelas objek, fiksasi dengan melewatkan gelas objek pada api bunsen. Tuangkan larutan
Karbol Kristal Ungu 0,5 pada sediaan dan biarkan selama 5 menit. Bilas dengan air. Cairan Lugol diteteskan di atas preparat selama 45-60 detik, kemudian dicuci
dengan air. Celupkan preparat dalam bejana berisi alkohol 96 goyang-goyangkan selama 30 detik atau hingga zat warna bersih. Preparat dicuci dengan air. Larutan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Safranin diteteskan di atas preparat, kemudian dibiarkan selama 1-2 menit, cuci dengan air dan keringkan. Tetesi minyak immersi diatas sediaan, amati dengan
mikroskop Atika, 2007.
3.4.9.2 Pembuatan Kurva tumbuh bakteri Bakteri S.dysentriae, S.aureus, B.subtilis, S.enterica sv thypimurium, dan
H.pylori diremajakan masing-masing sebanyak dua biakan, pertama sebagai biakan stok dan kedua sebagai biakan suspensi. Satu ose diambil dari kultur bakteri yang
akan diremajakan kemudian digoreskan ke agar miring. Biakan tersebut ditumbuhkan pada agar miring NA selama 24 jam pada suhu 37
℃. Biakan yang telah tumbuh pada agar miring NA, ditambahkan dengan 5mL
NaCl 0,9 wv steril. Sebanyak 2 mL suspensi bakteri diinokulasikan ke dalam erlenmeyer 250 mL yang berisi 200 mL NB Nutrient Broth, dikocok dan NB steril
tanpa suspensi bakteri sebagai kontrol. Spektrofotometer visible diatur dengan panjang gelombang 600 nm, kuvet dibersihkan kemudian diukur absorbansi awal
NB steril sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri pada menit ke-0 t .
Setelah absorbansi awal ditentukan, media NB diinkubasi pada pengocokan 120 rpm dengan temperature 37
℃. Setiap interval 30 menit dilakukan pengukuran absorban untuk mendapatkan kurva tumbuh. Kurva pertumbuhan diakhiri setelah
melewati fase stasioner Utami, 2009.
3.4.9.3 Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Cakram Suspensi bakteri 1 mL dimasukkan secara aseptis ke dalam cawan petri
steril kemudian ditambahkan media agar yang telah dibuat untuk masing-masing bakteri uji sejumlah 10mL. Suspensi kuman yang telah diberi agar dalam cawan
petri digoyangkan perlahan untuk memperoleh suspensi kuman yang tersebar merata pada media agar Rachmayani, 2008.
Uji aktivitas antibakteri dilakukan secara in vitro dengan metode difusi cakram. Larutan uji diserapkan ke dalam cakram sebanyak 20 µL. Cakram yang
sudah diresapi larutan uji diletakkan pada permukaan media uji kemudian diinkubasi Atika, 2007.
