24
Pada masing- masing lokasi ditunjuk 20 pohon induk, baik untuk keperluan analisis DNA maupun analisis morfologi. Jumlah sampel yang
digunakan untuk kegiatan analisis DNA dan morfologi disajikan pada Tabel 4. Tabel 4. Jumlah sampel kerja untuk kegiatan penelitian 1
Analisis DNA Analisis morfologi
a. 6 populasi mindi
b. 20 pohon induklokasi
c. 6 x 20 = 120 sampel DNA
d. 5 primer
a. 6 populasi mindi
b. 20 pohon induklokasi
c. Tinggi total : 120 sampel
d. Diameter : 120 sampel
e. Tinggi bebas cabang : 120 sampel
f. Buah : 10 x 20 x 6 = 1200 sampel
g. Benih : 10 x 20 x 6 = 1200 sampel
h. Daun : 5 x 20 x 6 = 600 sampel
3.3.1 Analisis keragaman genetik
Untuk analisis DNA metode yang digunakan adalah Random Amplified Polimorphic DNA
RAPD. Penanda genetik yang digunakan adalah lima primer yang berasal dari hasil seleksi dua puluh lima primer, adapun primer yang
mampu mengamplifikasi DNA mindi dan memperlihatkan pita polimorphik adalah primer OPA-07; OPY-13; OPY-16; OPA-09 dan OPO-05, yang diproduksi
oleh The Midland Certified Reagent Co. dengan susunan basa nukleotida seperti pada Tabel 5.
Tabel 5. Primer dan susunan basa yang digunakan
Primer Susunan Basa
OPA-07 5’-GAAACGGGTG-3’ OPY-13 5’-GGGTCTCGGT-3’
OPY-16 5’-GGGCCAATGT-3’ OPA-09 5’-GGGTAACGGG-3’
OPO-05 5’-CCCAGTCACT-3’
Bahan dan alat
Penelitian ini menggunakan 5–10 helai daun dari setiap pohon induk, daun tersebut dimasukkan dalam kantong plastik yang telah berisi silica gel,
25 selanjutnya disimpan di lemari pendingin dengan suhu ±5ºC sampai siap untuk
diekstrak DNA. Alat-alat yang digunakan di Laboratorium meliputi mortar dan pestel,
sarung tangan, pipet, pipet mikro, sentrifugasi, vortex, spatula, koleksi tabung, cetakan gel, bak elektroforesis, tray, microvawe, power supply, pH meter, gelas
piala, gelas ukur, timbangan analitik, pengaduk magnet, lemari pendingin, water bath, ultraviolet transiluminator dan kamera digital.
Prosedur kerja
Metode yang digunakan untuk analisis DNA adalah metode RAPD William et al. 1990, yang meliputi isolasi DNA, uji kualitas dan kuantitas DNA,
seleksi primer, amplifikasi DNA dan visualisasi hasil amplifikasi. Untuk mendapatkan ekstrak DNA dari setiap individu digunakan metode CTAB Doyle
dan Doyle 1987. Selanjutnya untuk mendapatkan amplifikasi DNA digunakan mesin PCR-PTC100 MJ Research, untuk reaksi PCR digunakan 2
μl DNA ditambah Master Taqgreen go taq Promega sebanyak 7,5
μl dan 2,5 μl Nuclease–free water
H
2
O serta 1,5 μl primer 0,5 – 2 M. Campuran tersebut
selanjutnya dimasukkan dalam mesin PCR-PTC100 MJ Research dengan pengaturan suhu dan tahapan reaksi dengan total siklus 37 kali, yaitu pre
denaturasi 1 kali suhu 95ºC selama 2 menit dilanjutkan denaturasi pada suhu
95ºC selama 1 menit, kemudian annealing dengan suhu 35ºC selama 2 menit dan extension
pada suhu 72ºC selama 2 menit, tahap ini berlangsung 35 kali dan terakhir adalah final extension 1 kali suhu72ºC selama 5 menit. Hasil PCR
selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan agarose 2 pada tegangan 100 Volt selama ±25 menit kemudian dilakukan perendaman pada EtBr selama 15
menit, selanjutnya dilihat pada UV transiluminator, dan dilakukan pemotretan. Hasil pemotretan dianalisis, yaitu dengan menggunakan skoring pada pita yang
muncul. Penjelasan mengenai prosedur kerja analisis DNA mindi dapat dilihat pada Lampiran 1.
Analisis data
Pada metode RAPD pola pita yang muncul diterjemahkan ke dalam data biner berdasarkan ada atau tidaknya pita. Pendugaan keragaman genetik dalam
populasi dan antar populasi dilakukan dengan bantuan program POPGENE
26 ver.1.31 Yeh et al. 1999, NTSYS 2.02 Rohlf 1998. dan GenAlEx 6.3 Peakall
dan Smouse 2006. Adapun parameter keragaman genetik yang dihitung dalam penelitian ini adalah persentase lokus polimorfik PLP; jumlah alel yang teramati
na; jumlah alel yang efektif ne; heterozigitas harapan He, diferensiasi genetik Gst, Principal Coordinates Analaysis PCA dan Analysis of Molecular
Vari ance AMOVA.
3.3.2 Analisis morfologi
Metode yang digunakan dalam analisis morfologi adalah pengamatan dan pengukuran yang dilakukan pada setiap individu pohon mindi di setiap lokasi asal
benih. Pengamatan dan pengukuran dilakukan terhadap tinggi total, tinggi bebas cabang, diameter batang, morfologi daun, produksi buah, berat buah, panjang
buah, diameter buah, berat benih, panjang benih, diameter benih dan berat 1000 butir.
Bahan dan alat
Bahan yang digunakan adalah 20 pohon induk yang telah ditunjuk di setiap lokasi penelitian. Adapun alat yang digunakan untuk pengumpulan data
morfologi tegakan adalah haga, pita meteran, galah berkait, teropong, caliper, timbangan dan kamera.
Prosedur kerja
Beberapa variabel morfologi pohon mindi yang diamati pada penelitian ini adalah tinggi total, tinggi bebas cabang, diameter pohon, produksi buah, berat
buah per butir, diameter buah, panjang buah, berat benih per butir, morfologi daun dan berat 1000 butir.
Pengukuran buah dan benih mindi
p d
p d
27 Gambar 6. Cara pengukuran panjang p dan diameter d buah dan benih mindi
28
Pengukuran morfologi daun
Pengukuran morfologi daun dilakukan pada 5 lima helai daun yang berasal dari 20 dua puluh pohon induk dari 6 enam populasi mindi.
Pengukuran menggunakan metode yang telah digunakan untuk mengukur morfologi daun jenis Quercus sp. Kremer et al. 2002, adapun karakter yang
diukur adalah lima dimensi karakter daun LL, PL, LW, SW dan WP, dua variable terukur NL dan NV dan satu didasarkan pada nilai scoring BS.
LL laminal length : panjang helai daun
PL petiole length : panjang tangkai daun
LW lobe width : lebar dari tulang daun utama ke titik terlebar pada
bagian helai daun SW sinus width
: lebar terhadap sudut daun WPwidest point
: panjang dari pangkal daun ke titik terlebar pada bagian helai daun
NL number of lobes : jumlah lekukan terluar dari helai daun kanan dan
kiri tulang daun NV number of intercalary veins
: jumlah rangka daun BS Basal shape of lamina
: bentuk dasar helai daun skoring 1- 3
Cara pengukuran semua karakter dapat dilihat pada Gambar 7 dan 8.
Gambar 7. Cara pengukuran terhadap lima karakater morfologi PL, LL, WP, LW dan SW daun mindi Sumber: Kremer et
al. 2002
29
Gambar 8. Penilaian untuk karakter BS Sumber: Kremer et al. 2002 Analisis data
Untuk mengetahui keragaman karakteristik morfologi individu pohon, maka digunakan metoda analisis statistika peubah ganda Analysis Multivariate,
yaitu melalui pendekatan dengan menggunakan Principal Component Analysis PCA, Canonical Discriminant Analysis CDA, Predicted Group Membership
dan Clustering. Pengolahan data menggunakan software SPSS ver 15.
3.3.3 Analisis kesuburan tapak tanaman mindi
Sebagai data pendukung untuk mengetahui sumber daya mindi di hutan rakyat dilakukan analisis kesuburan tapak, yaitu untuk mengetahui status hara
pada setiap lokasi penelitian. Analisis ini berdasarkan data sekunder dan primer. Data sekunder diperoleh berdasarkan hasil penelitian Atmandhini 2011 yang
telah melakukan analisis pengaruh faktor tempat tumbuh terhadap produksi buah mindi di hutan rakyat Jawa Barat. Sedangkan data primer diperoleh dari hasil
analisis kadar hara pada daun.
Bahan dan alat
Bahan yang digunakan untuk dapat menilai kondisi kesuburan tapak di bawah tegakan mindi di hutan rakyat di Jawa Barat adalah data sekunder
Atmandhini 2011 dan contoh daun mindi dari setiap lokasi penelitian sebagai bahan untuk analisis jaringan.
Prosedur kerja Pengambilan contoh daun
Contoh daun diambil secara acak pada setiap populasi di enam populasi tanaman mindi di hutan rakyat. Contoh daun diambil sebanyak 3 ulangan dari
30 setiap lokasi. Selanjutnya daun dianalisis di laboratorium, adapun unsur kimia
yang dianalisis yaitu C, N, P, K serta kadar air.
Analisis data
Hasil analisis hara pada jaringan daun selanjutnya dibandingkan dengan nilai standar kecukupan dan kekurangan beberapa unsur hara makro untuk
beberapa jenis ekaliptus Dell et al. 2003, sebagai salah satu tanaman kehutanan, karena standar kecukupan hara untuk tanaman mindi belum ada.
3.4 Teknik Penanganan dan Perkecambahan Benih Mindi untuk
Pengembangan Sumber Benih di Hutan Rakyat 3.4.1 Bahan dan alat
Bahan digunakan dalam penelitian ini adalah benih mindi yang dipanen
dari 20 pohon induk pada setiap lokasi tanaman mindi Gambar 9. Bahan yang
digunakan untuk pematahan dormansi adalah larutan asam sulfat H
2
SO
4
dengan konsentrasi 95, air accu dan air kelapa muda. Untuk perkecambahan digunakan
media campuran tanah dan pasir. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah galah berkait, karung, bak kecambah, tampah, lantai jemur, seng, label,
oven, mikroskop, kamera digital dan timbangan analitik.
3.4.2. Tempat Penelitian
Pengamatan struktur anatomi benih dilakukan di Laboratorium Anatomi Kayu, Pusat Penelitian Teknologi dan Pengolahan Hasil Hutan, Badan Litbang
Kehutanan Bogor, sedangkan pengujian kandungan biokimia kulit benih dilakukan di Laboratorium Balai Penelitian Obat dan Aromatik, Kementrian
Pertanian serta di Laboratorium Kimia Kayu, Fakultas Kehutanan, IPB. Selanjutnya pengujian pematahan dormansi dan perkecambahan dilakukan di
Laboratorium Balai Teknologi Perbenihan Bogor.
31
a b
c Gambar 9. Penunjukkan pohon induk a, pengunduhan buah b dan c
3.4.3 Pengumpulan data Pengumpulan data didasarkan pada hasil pengujian benih di laboratorium,
meliputi a pengamatan struktur anatomi dan biokimia benih, b pengujian pematahan dormansi secara mekanis dan kimia serta c pengujian viabilitas dan
vigor benih. Jumlah sampel kerja untuk setiap kegiatan adalah sebagai berikut Tabel 6.
Tabel 6. Jumlah sampel untuk analisis anatomi, biokimia dan pematahan
dormansi benih mindi
Anatomi benih Biokimia benih
Pematahan dormansi mekanis dan kimiawi
6 lokasi masing-masing 5 butir
6 lokasi masing- masing 100 g
Masing-masing lokasi : 10 perlakuan, 4 ulangan 50 butir
3.4.4 Prosedur Kerja : 3.4.4.1 Pengukuran struktur anatomi benih mindi
Penelitian struktur anatomi benih dilakukan tiga tahap: 1 pembuatan preparat; 2 pengamatan dan pengukuran; serta 3 pembuatan foto mikroskopis
dan makroskopis dari setiap penampang yang telah dibuat Lampiran 2..
Tahap 1.
Dalam pembuatan preparat, contoh benih mindi harus dilunakkan terlebih dahulu sebelum disayat, dalam pembuatan preparat ini digunakan Metode Sass
Sass 1961. Karakter kulit benih mindi termasuk dalam jenis kayu yang keras
