133
3. Seleksi Primer
Sebelum dilakukan proses PCR terhadap DNA, terlebih dahulu dilakukan seleksi primer. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan primer yang cocok untuk
proses amplifikasi DNA, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan amplifikasi. Pada penelitian ini dilakukan seleksi terhadap 25
primer. Adapun tahap proses seleksi primer adalah sebagai berikut: a.
Mengambil DNA hasil ekstraksi masing-masing sebanyak 1 μl, dicampurkan,
mejadi bulk DNA atau DNA total. b.
Ambil sebanyak 1 μl DNA total kemudian dicampur dengan 99 μl aquabides,
menjadi DNA mix 100 x. c.
Untuk reaksi PCR dalam seleksi primer, untuk setiap primer yang akan diuji, mencampurkan Master Taqgreen go taq sebanyak 7,5
μl + Nuclease – free water H
2
O 2,5 μl + DNA mix sebanyak 2 μl + primer 1,5 μl. Campuran ini
disentrifugasi selama 5 – 10 detik. d.
Masukkan dalam mesin PCR selama ± 4 jam dengan pengaturan suhu dan tahapan reaksi dengan total siklus adalah 37 kali, seperti penjelasan Tabel 30.
Tabel 30. Tahapan Dalam Proces PCR Tahapan
Suhu ° C Waktu menit
Jumlah siklus Pre denaturasi
95 2
1 Denaturasi
Annealing Extension
95 35
72 1
2 2
35 Final extension
72 5
1 e.
Setelah proses PCR selama ± 4 jam tube, dikeluarkan selanjutnya dilakukan running elektroforesis dengan menggunakan agarose 2 yaitu 0,30 g agarose
dicampur 15 ml TAE. Setiap lubang gel diisi oleh campuran DNA sebanyak 5 μl, sedangkan marker diletakkan pada lubang bagian awal sebanyak 4 μl
Adapun Tegangan listrik yang digunakan 90 volt selama 24 menit. f.
Setelah itu dilakukan perendaman dalam EtBr selama 15 menit, dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator, dan dilakukan pemotretan.
Primer yang menghasilkan pita atau jumlah amplifikasi yang terbanyak selanjutnya digunakan untuk amplifikasi DNA dari 15 sample yang diuji.
4. Amplifikasi DNA
Setelah diketahui primer yang menghasilkan pita atau jumlah amplifikasi terbanyak terpilih 5 primer , maka selanjutnya dilakukan amplifikasi untuk
setiap sample DNA yang diuji. Tahapan kegiatan adalah sebagai berikut:
134 a.
Ambil masing-masing DNA hasil pengenceran sebanyak 2 μl kemudian
masukkan dalam tube yang berbeda 1 DNA 1 tube. Setiap tube ditambahkan 7,5 green go + 2,5 aquadest + 1,5 primer x. Campuran ini selanjutnya
disentrifuse.
b. Masukkan dalam mesin PCR selama ± 4 jam dengan pengaturan suhu dan
tahapan reaksi dengan total siklus adalah 37 kali. c.
Setelah proses PCR selama ± 4 jam selanjutnya dilakukan running elektroforesis dengan menggunakan agrose 2 yaitu 0,30 g agarose dicampur
15 ml TAE. Setiap lubang gel diisi oleh campuran DNA sebanyak 5 μl,
sedangkan marker diletakkan pada lubang bagian awal sebanyak 4 μl.
Tegangan listrik yang digunakan 90 volt selama 24 menit. d.
Setelah itu dilakukan perendaman dalam EtBr selama 15 menit, selanjutnya dilihat pada UV transiluminator, dan dilakukan pemotretan dengan foto gel.
e. Seragam tidaknya DNA dari setiap individu diamati dari pita yang dihasilkan.
5. Analisis Data
Pita DNA diterjemahkan dalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita dengan ketentuan nilai 0 nol untuk tidak ada pita dan nilai 1 satu untuk adanya pita
pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan. Data yang diperoleh, diolah dengan menggunakan software Popgene versi 1.31 dan
Unweighted Pair Grouping Method with Arithmatic Averaging UPGMA dengan
software NTSYS versi 2.0 dan Genalex ver 6.0 Peakall Smouse 2006
Kategori