134 a.
Ambil masing-masing DNA hasil pengenceran sebanyak 2 μl kemudian
masukkan dalam tube yang berbeda 1 DNA 1 tube. Setiap tube ditambahkan 7,5 green go + 2,5 aquadest + 1,5 primer x. Campuran ini selanjutnya
disentrifuse.
b. Masukkan dalam mesin PCR selama ± 4 jam dengan pengaturan suhu dan
tahapan reaksi dengan total siklus adalah 37 kali. c.
Setelah proses PCR selama ± 4 jam selanjutnya dilakukan running elektroforesis dengan menggunakan agrose 2 yaitu 0,30 g agarose dicampur
15 ml TAE. Setiap lubang gel diisi oleh campuran DNA sebanyak 5 μl,
sedangkan marker diletakkan pada lubang bagian awal sebanyak 4 μl.
Tegangan listrik yang digunakan 90 volt selama 24 menit. d.
Setelah itu dilakukan perendaman dalam EtBr selama 15 menit, selanjutnya dilihat pada UV transiluminator, dan dilakukan pemotretan dengan foto gel.
e. Seragam tidaknya DNA dari setiap individu diamati dari pita yang dihasilkan.
5. Analisis Data
Pita DNA diterjemahkan dalam data biner berdasarkan ada tidaknya pita dengan ketentuan nilai 0 nol untuk tidak ada pita dan nilai 1 satu untuk adanya pita
pada suatu posisi yang sama dari setiap individu yang dibandingkan. Data yang diperoleh, diolah dengan menggunakan software Popgene versi 1.31 dan
Unweighted Pair Grouping Method with Arithmatic Averaging UPGMA dengan
software NTSYS versi 2.0 dan Genalex ver 6.0 Peakall Smouse 2006
135
Lampiran 2. Tahapan persiapan pengamatan struktur anatomi dan dimensi serat kulit benih mindi
1. Persiapan dan pengukuran struktur anatomi
Penelitian struktur anatomi benih dilakukan tiga tahap, yaitu 1 pembuatan preparat, 2 pengamatan dan pengukuran, serta 3 pembuatan foto mikroskopis
dari ketiga penampang yang telah dibuat. Contoh benih dilunakkan terlebih dahulu sebelum disayat. Pelunakan contoh benih dilakukan sebagai berikut:
merebusnya selama 2 x 6 jam dalam panci presto lalu direndam dalam alkohol gliserin 1 : 1 selama 1 minggu sebelum disayat. Contoh benih selanjutnya
direndam dalam aquadestilata selama 3 hari lalu dipindahkan ke dalam larutan alkohol gliserin 1 : 1 selama 1 minggu sebelum disayat.
Karena embrio benih lunak dan mudah koyak, digunakan PEG dengan metode sebagai berikut: contoh benih yang telah dirapikan direndam dalam
campuran PEG 4000 dan alkohol 96 dengan perbandingan 1 : 5, kemudian dimasukkan dalam oven dengan suhu 60ºC selama kurang lebih 5 hari
indikatornya sampai tinggi larutan tersebut tidak berkurang lagi atau stabil, yang berarti PEG sudah mengisi semua rongga sel. Kemudian contoh uji bersama
larutannya dipindahkan ke dalam kotak kertas dibuat secara khusus, dan dibekukan ke dalam lemari pendingin hingga cukup keras untuk disayat.
Setelah cukup lunak atau cukup keras yang menggunakan PEG, contoh benih disayat dengan mikrotom setebal 15-25 mikron. Sayatan yang dibuat
meliputi penampang lintang dan penampang transversal. Sayatan yang baik lalu dipilih dan dicuci dalam aquades lalu dihilangkan kandungan airnya didehidrasi
berturut-turut dengan alkohol 30, 50, 70, 96 dan alkohol absolut. Selanjutnya sayatan dibeningkan dengan cara merendamnya beberapa saat,
berturut-turut dalam karboxylol dan toluene. Sesudah itu sayatan direkat dengan entelan di atas object glass Sass 1961
.
Metode Sass 1961: Sass JE. 1961. Botanical Microtechnique. Third edition. The IOWA State University Press. Amess. Iowa.
