23
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian ekperimental murni menggunakan metode desain faktorial yang bersifat eksploratif dengan dua faktor dan dua level.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah level CMC-
Na dan gliserin yang digunakan dalam formulasi. b.
Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik gel yang meliputi organoleptis, pH, viskositas dan daya sebar, serta
stabilitas sediaan gel pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama 4 minggu.
c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini adalah waktu panen, umur, habitat tumbuh, cara panen dari tanaman cocor bebek, lama dan kecepatan pencampuran saat pembuatan
gel, lama penyimpanan, wadah yang digunakan untuk menyimpan sediaan gel, umur, jenis kelamin, serta galur tikus yang digunakan.
d. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali
dalam penelitian ini adalah suhu dan kelembaban udara pada saat pembuatan dan penyimpanan.
2. Definisi operasional
a. Gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek adalah sediaan semipadat
yang dibuat dari ekstrak daun cocor bebek dengan gelling agent CMC- Na dan humektan gliserin sesuai dengan formula dan prosedur
pembuatan yang telah ditentukan dalam penelitian ini. b.
Ekstrak kental daun cocor bebek adalah hasil dari proses maserasi serbuk daun cocor bebek dengan pelarut etanol, yang diuapkan menggunakan
rotary evaporator dan dilanjutkan penguapan diatas waterbath pada suhu
70
o
C selama 3 jam dengan pengadukan setiap 30 menit. c.
Gelling agent adalah bahan penyusun struktur jaringan gel yang dapat
mempengaruhi sifat fisik sediaan gel, dalam penelitian ini digunakan CMC-Na.
d. Humektan adalah bahan yang berfungsi sebagai pelembab dalam sediaan
gel di mana merupakan faktor yang akan dioptimasi dalam penelitian ini, dalam hal ini adalah gliserin.
e. Sifat fisik adalah sifat gel yang dapat dilihat kenampakan fisiknya dan
dapat diukur baik secara kualitatif maupun kuantitatif yang meliputi daya sebar, viskositas, kemampuan penetrasi, pH, dan organoleptis.
f. Stabilitas fisik gel adalah sifat gel dalam mempertahankan kestabilannya
yang dilihat dari pergeseran viskositas. g.
Pergeseran viskositas adalah selisih dari viskositas gel setelah 4 minggu penyimpanan dalam suhu kamar dengan viskositas gel setelah 2 hari
pembuatan.
h. Faktor adalah variabel yang diteliti di dalam penelitian CMC-Na dan
gliserin. i.
Level adalah tetapan atau nilai dari suatu faktor yang dinyatakan secara numerik.
j. Respon adalah besaran yang diamati, perubahan efek dan besarnya dapat
dinyatakan secara kuantitatif. Dalam penelitian ini adalah sifat fisik dan stabilitas fisik gel.
k. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan oleh variasi level dari
faktor. l.
Contour plot adalah grafik yang merupakan area optimum dari formula
yang menunjukkan parameter sediaan gel yang baik. m.
Area optimum adalah area dari komposisi CMC-Na dan gliserin yang memberikan sifat fisik dan stabilitas sediaan gel yang baik, yaitu daya
sebar 5-7 cm, viskositas 150-250 dPas, serta perubahan viskositas selama penyimpanan ≤ 10.
C. Bahan Penelitian
Daun cocor bebek yang diperoleh dari kebun obat Universitas Sanata Dharma, aquadest, CMC-Na kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas
farmasetis, gliserin kualitas farmasetis, metil paraben kualitas farmasetis, etanol 70 kualitas farmasetis, suspensi karagenan-salin 1, dan tikus jantan
galur Sprague Dawley.
D. Alat Penelitian
Oven, blender, erlenmeyer, maserator seri OS-762 OPTIMA-JAPAN, corong Buchner, labu hisap, vacuum rotary evaporator, gelas ukur, wadah plastik,
sendok, pipet ukur, propipet, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk, cawan arloji, gelas Beaker, mixer Maspion seri MT-1150, viskometer seri VT 04 RION-
JAPAN, stopwatch, waterbath, pH stik, seperangkat alat uji daya sebar, dan jangka sorong digital.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman cocor bebek Kalanchoe pinnata Lam.
Determinasi tanaman cocor bebek dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi bertujuan untuk
memastikan kebenaran dari tanaman yang akan digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan dengan mengacu pada Backer dan van Den Brink 1963.
2. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek
a. Pengumpulan dan cara panen daun cocor bebek. Bibit daun cocor bebek
diperoleh dari tempat budidaya tanaman obat Merapi Farma yang terdapat di daerah Kaliurang, Yogyakarta. Kemudian bibit dibudidayakan secara
mandiri di kebun obat kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Paingan. Tanaman dipanen pada umur tiga bulan sebelum tanaman
berbunga. Daun hasil panen dicuci dengan air mengalir sortasi basah untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel. Selanjutnya daun
yang sudah dicuci diangin-anginkan kemudian dikeringkan sampai daun
benar-benar kering. Parameter kering adalah daun mudah dipatahkan atau hancur bila diremas. Simplisia yang sudah kering diserbuk dengan
menggunakan blender. b.
Pembuatan ekstrak kental daun cocor bebek. Simplisia serbuk ditimbang sejumlah 40 g dimaserasi dalam 100 mL etanol 70. Maserasi dilakukan
selama 48 jam. Selanjutnya larutan disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa vacuum. Residu yang didapat kemudian diuapkan
menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 55
o
C dan dilanjutkan di atas waterbath pada suhu 70
o
C selama 3 jam dengan pengadukan setiap 30 menit. Metode ini mengacu pada penelitian Nwose
2013 dengan modifikasi pelarut dan proses pemekatan. c.
Uji kandungan flavonoid. Pengujian kandungan flavonoid dalam ekstrak daun cocor bebek secara kualitatif dan kuantitatif dilakukan oleh LPPT
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan metode spektrofotometri visibel dan dengan quercetin sebagai standar pembanding. Panjang
gelombang yang digunakan 510 nm.
3. Formulasi gel
a.
Formula. Formula yang digunakan dalam penelitian ini mengacu formula dalam penelitian
“Formulasi dan Uji Efektifitas Gel Luka Bakar Ekstrak Daun Cocor Bebek Kalanchoe pinnata
L. pada Kelinci Oryctogalus cuniculus
” oleh Hasyim dkk. 2012.
Tabel II. Formula gel ekstrak daun cocor bebek
Nama Bahan Komposisi bv
Ekstrak Cocor Bebek 2,5
Carbopol 0,6
Trietanolamin 0,81
Gliserol 25
Propilenglikol 5
Metil Paraben 0,18
Etanol 70 0,5
Air ad
100 Hasyim dkk., 2012.
Formula seperti pada tabel II selanjutnya dimodifikasi menjadi formula dengan komposisi gelling agent dan humektan seperti tersaji dalam tabel
III.
Tabel III. Formula modifikasi gel ekstrak daun cocor bebek
Nama Bahan FAB
gram FA
gram FB
gram F1
gram
Ekstrak cocor bebek 5
5 5
5
CMC-Na 7,5
7,5 6
6 Gliserin
60 30
60 30
Trietanolamin 1,62
1,62 1,62
1,62 Metil paraben
0,36 0,36
0,36 0,36
Etanol 70 1
1 1
1 Aquadest
162 162
162 162
b. Pembuatan gel. CMC-Na dikembangkan dalam 100 ml aquadest, dengan
cara menaburkan CMC-Na di atas aquadest. Proses pengembangan dilakukan selama 24 jam. Metil paraben dilarutkan dengan etanol 70 lalu
dicampurkan dengan gliserin, dan ekstrak aquadest berfungsi sebagai pembilas. Selanjutnya campuran tersebut ditambahkan dengan CMC-Na
yang telah dikembangkan sebelumnya. Semua bahan diaduk kuat menggunakan mixer dengan kecepatan putar level 1, selanjutnya pada
menit pertama ditambahkan trietanolamin ke dalam campuran, pengadukan dilanjutkan sampai menit kelima.
4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel
a. Uji organoleptis. Uji organoleptis dilakukan terhadap penampilan fisik
sediaan gel ekstrak daun cocor bebek meliputi warna, bau, dan homogenitas.
b. Uji pH. Pengukuran pH dilakukan menggunakan pH stik. Sediaan gel
dioleskan secukupnya pada stik, kemudian dibandingkan warnanya dengan standar untuk menentukan pH. Uji pH dilakukan 48 jam, 1 minggu, 2
minggu, 3 minggu, dan 4 minggu setelah formulasi. c.
Uji viskositas. Uji viskositas dilakukan 48 jam setelah pembuatan, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu, dan 4 minggu penyimpanan. Masing-masing
formula gel diukur viskositasnya dengan menggunakan alat Viscotester Rion
seri VT 04. Ukuran paddle yang digunakan adalah skala 2 karena area viskositas yang diteliti adalah 100-4000 dPas. Sediaan gel
dimasukkan ke dalam cup sampai terisi ¾ cup. Selanjutnya paddle dipasangkan ke rotor secara tegak lurus. Cup dipasang lalu rotor
dinyalakan. Nilai viskositas ditunjukkan oleh jarum penanda. d.
Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah 48 jam, 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu, dan 4 minggu penyimpanan. Gel
ditimbang sejumlah 1 gram kemudian diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala. Di atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat
sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya Garg dkk., 2002.
5. Uji aktivitas anti-inflamasi
Uji aktifitas anti-inflamasi gel ekstrak daun cocor bebek dilakukan pada tikus jantan galur Sprague Dawley dengan tata cara penelitian metode radang
telapak kaki belakang.
a. Penyiapan hewan uji. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini
adalah tikus jantan galur Sprague Dawley umur 2-3 bulan dengan berat badan 100-200 gram. Tikus diberi pra perlakuan dengan dipuasakan
selama 12 jam. Kelompok perlakuan terdiri dari kontrol negatif suspensi karagenan-salin 1, kontrol positif gel Voltadex
®
, dan sediaan gel ekstrak daun cocor bebek dengan formula optimum.
b. Pembuatan larutan NaCl 0,9. NaCl ditimbang sebanyak 0,9 gram
kemudian dilarutkan dengan aquadest dalam labu ukur 100 ml. c.
Pembuatan suspensi karagenan-salin 1. Karagenan ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan larutan NaCl 0,9 dalam labu takar 10 ml.
d. Perlakuan hewan uji. Hewan uji dibagi menjadi :
1 Kelompok kontrol negatif suspensi karagenan-salin 1.
Kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital sebelum diinjeksi dengan suspensi karagenan-salin 1 secara subplantar
dinyatakan sebagai Y . Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus
dilakukan pada menit ke-0, 30, 60, 120, dan 180 setelah injeksi.
2 Kelompok kontrol positif gel Voltadex
®
. Kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital
dinyatakan sebagai Y . Setelah itu dioleskan dengan gel Voltadex
®
. Satu jam setelahnya, kaki kiri belakang tikus tersebut diinjeksikan 0,5 ml
suspensi karagenan-salin 1 secara subplantar. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 sebelum pengolesan gel
Voltadex
®
, 30, 60, 120, dan 180 setelah injeksi. 3
Kelompok perlakuan sediaan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek dengan formula optimum.
Kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital dinyatakan sebagai Y
. Setelah itu dioleskan dengan formula gel optimum. Satu jam setelahnya, kaki kiri belakang tikus tersebut
diinjeksikan 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1 secara subplantar. Pengukuran ketebalan kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 sebelum
pengolesan gel ekstrak daun cocor bebek, 30, 60, 120, dan 180 setelah injeksi.
e. Pengukuran inhibisi. Pengukuran ketebalan kaki tikus diukur
menggunakan jangka sorong digital. Kemudian dihitung nilai edema tiap waktu persamaan 2 dan dihitung nilai AUC total masing-masing
perlakuan persamaan 3. Nilai edema tiap waktu dihitung dengan rumus: Yu = Yt
–Yo…………………………..............................………………2 Keterangan:
Yu = edema kaki tikus pada waktu tertentu mm
Yt = tebal kaki tikus pada waktu tertentu setelah diradangkan dengan suspensi karagenan-salin 1 mm
Yo = tebal kaki tikus sebelum diradangkan dengan suspensi karagenan- salin 1 mm
Taufiq, Wahyuningtyas dan Wahyuni, 2008. Nilai AUC total masing-masing perlakuan dengan rumus:
...............................................3 = area dibawah kurva dari jam ke-0 sampai jam ke-3 mm.jam
= edema telapak kaki pada jam ke-n-1 mm = edema telapak kaki pada jam ke-n mm
= jam ke-n jam = jam ke-n-1 jam
Taufiq dkk., 2008. Persen inhibisi dihitung dengan rumus:
........4 =
rata – rata kontrol negatif mm.jam
= masing-masing tikus pada kelompok yang diberi
perlakuan n mm.jam Taufiq dkk., 2008.
F. Optimasi Formula dan Analisis Data
Data sifat fisik gel yang diperoleh dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek dari CMC-Na, gliserin, dan
interaksinya. Analisis menggunakan pendekatan desain faktorial untuk menghitung koefisien b
, b
1
, b
2
, b
12
sehingga didapatkan persamaan Y = b + b
1
X
1
+ b
2
X
2
+ b
12
X
1
X
2
. Persamaan ini kemudian digunakan untuk membuat contour plot
sifat fisik gel ekstrak daun cocor bebek. Masing-masing contour plot digabungkan menjadi contour plot superimposed untuk mengetahui area
komposisi optimum CMC-Na dan gliserin, terbatas pada level yang diteliti. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program R.3.1.2 dengan uji two
way ANOVA pada taraf kepercayaan 95. Tahapan analisis data adalah uji normalitas data, uji variansi data, dan
ANOVA. Uji normalitas data dilakukan dengan Shapiro Wilk. Suatu data dikatakan normal bila memiliki p-value 0,05. Selanjutnya dilakukan uji variansi
data dengan Levene’s test untuk mengetahui homogenitas data. Data dikatakan
memiliki kesamaan varian bila memiliki p-value 0,05. Apabila data terdistribusi normal dan memiliki kesamaan varian maka dilanjutkan dengan uji two way
ANOVA. Uji ANOVA bertujuan untuk mengetahui signifikansi efek dari masing- masing faktor yaitu CMC-Na dan gliserin serta interaksi keduanya sehingga dapat
diketahui faktor dominan yang mempengaruhi sifat fisik gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek. Faktor dikatakan memiliki pengaruh signifikan terhadap sifat
fisik dan stabilitas fisik gel bila memiliki p-value 0,05.
34
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tumbuhan
Tanaman yang akan digunakan dalam penelitian ini dideterminasi terlebih dahulu. Tujuan determinasi adalah memastikan kebenaran dari tanaman
yang digunakan dalam penelitian. Determinasi dilakukan dengan mengacu literatur yaitu pada Backer dan van Den Brink 1963. Proses determinasi yaitu
dengan mencocokan ciri morfologi tanaman dengan kunci determinasi. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini
adalah benar cocor bebek Kalanchoe pinnata Lam.. Pembuktian kebenaran dari tanaman yang digunakan juga diperkuat dengan adanya surat determinasi
tanaman yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Lampiran 1.
B. Pengumpulan dan Penyerbukan Simplisia
Cocor bebek yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Tanaman tersebut merupakan
tanaman yang ditanam secara mandiri oleh peneliti. Sebelumnya peneliti memperoleh bibit cocor bebek dari Merapi Farma, Kaliurang. Tempat
pengambilan tanaman pada satu tempat ini diharapkan metabolit yang terkandung di dalamnya seragam. Hal itu dikarenakan tanaman mendapatkan perlakuan yang
sama. Daun cocor bebek dipanen saat berumur kurang lebih tiga bulan sebelum
Kategori