2.1.8 Polymerase Chain Reaction PCR
Prinsip dasar PCR dapat dikatakan sederhana. Seperti namanya yakni reaksi berantai: satu molekul DNA digunakan untuk menghasilkan dua salinan,
lalu empat, delapan dan seterusnya. Penggandaan terus menerus ini dilakukan oleh protein tertentu yang dikenal sebagai polimerase, enzim yang mampu
membuat satu untaian DNA individu untuk membentuk untaian molekul yang panjang. Oleh karena itu diperlukan fragmen DNA yang terdiri dari empat asam
nukleat, yakni adenin A, timin T, sitosin C dan guanin G. Mereka juga membutuhkan fragmen kecil DNA, yang dikenal sebagai primer. Jika bahan telah
tersedia, enzim akan membentuk fragmen baru sama seperti pada template. PCR adalah metode digunakan untuk memperbanyak salinan dari setiap untai tertentu
asam nukleat. Hal ini berarti PCR selektif memperkuat sebuah segmen tertentu DNA.
25
Secara umum PCR membutuhkan target DNA sepanjang 100-1000 base pairs
bp. Secara teknik sulit untuk mengamplifikasi DNA dengan panjang 500 bp. Primer yang biasa digunakan memiliki panjang 20-20 nukleotida. Dalam
proses PCR, dibutuhkan beberapa bahan seperti thermal cycler dan PCR amplification mix
, yang terdiri dari sampel dsDNA, thermostable DNA polymerase
, dua primer oligonukleotida, deoxynucleotide triphosphat dNTPs, dan penyangga reaksi yang mengandung ion magnesium dan komponen lainnya
22. Berikut prosedur dalam PCR yang umum digunakan : a.
DNA didenaturasi oleh panas dengan suhu 90-95
o
C selama 20 detik. Dua untai terpisah karena rusaknya hidrogen yang mengikat mereka.
b. Campuran reaksi mengandung mengandung 4 deoxynucleotide
triphosphates dATP, dCTP, dGTP, dTTP dan thermostable DNA
polymerase . DNA polimerase tidak mengalami denaturasi pada suhu
yang tinggi. Campuran tersebut kemudian mengalami pendinginan, suhu diturunkan menjadi 50-65
o
C.
c. Setiap helai molekul DNA mengalami proses annealing dengan primer
oligonukleotida melengkapi kedua ujung urutan target yang membutuhkan waktu 20 detik.
d. Suhu dinaikkan ke 60-75
o
C dan primer diperluas oleh aksi polimerase DNA selama 30 detik. Polimerase yang mensintesis urutan
komplementer 5 ke 3 arah dari masing-masing primer. Jika template mengandung nukleotida A, enzim menambahkan pada nukleotida T
untuk primer. Jika template berisi G, ia menambahkan C untuk rantai baru. Pada titik ini ada akan persis dua salinan dari urutan DNA target.
e. Campuran dipanaskan lagi di 90-95
o
C untuk denaturasi molekul dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian
bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi amplifikasihasil pada eksponensial logaritmik tingkat, yaitu jumlah
DNA yang dihasilkan ganda pada setiap siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon.
2.1.9. Metode High Resolution Melt HRM
Kategori