Lanjutan
Real Time PCR HRM Light Cycler 480
®
II Roche 04 909
631 001 Multiwall Plate Light
Cycler
®
Roche HRM Kit
MgCl
2
Primer Forward dan Reverse
dH
2
O sampel DNA
7,5 μL 1,2 μL
0,75 μL 1,8 μL
3,75 μL
3.5. Cara Kerja Penelitian
3.5.1. Pengumpulan Data
Cara pengambilan data dalam penelitian ini yaitu data primer. Data responden diperoleh dengan cara tes kadar Hb mahasiswa dengan menggunakan
alat EasyTouch GCHb
®
mater , dan punksi vena untuk skrining SNP rs855791
CT. Responden sebanyak 102 orang yang telah mengisi lembar informed
consent lampiran 1 dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 cc satu kali dan
pemeriksaan kadar Hb. Sampel darah diberi nomor dan disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian dilakukan teknik Real Time PCR-
HRM dan selanjutnya dianalisis.
3.5.2. Desain gblock dan Primer
Proses perancangan gblock dan primer membutuhkan TMPRSS6 Gene Sequence
untuk melihat secara keseluruhan urutan basa nukleotida dan melihat area mutasinya. Langkah kerja desain primer yang spesifik untuk mendeteksi
IRIDA pada penelitian ini adalah sebagai berikut : a.
Website http:simgene.comPrimer3 dibuka.
b. Data sekuensing, primer forward dan reverse TMPRSS6 disalin dan
dipindahkan kedalam kolom data primer3.
Primer yang digunakan dalam penelitian ini adalah 5’ TCT GCA GAA
AGT GGA TGT GC 3’ forward dan 5’ CTC ACC TGA CAG GCA TCC TT 3’
reverse. c.
Tombol “Pick Primers” ditekan. Kemudian Primer3 OUTPUT berikut ini akan muncul.
Langkah kerja desain gBlock yang spesifik untuk mendeteksi IRIDA pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
a. Website
https:www.idtdna.compagesproductsgenesgblocks-gene- fragments dibuka.
b. Tombol “Product Services” ditekan. Kolom “gBlocks GeneFragments”
ditekan. Tombol “Order” ditekan.
c. Data sekuensing DNA TMRSS6 dimasukkan kedalam kolom data
sekuensing. Tombol “Test Complexity” ditekan.
3.5.3. Isolasi DNA
Setelah sampel darah diambil, dilakukan isolasi DNA untuk mendapatkan genom DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit BloodCultured Cell
Geneaid GB100 dengan langkah kerja seperti dalam tabel 3.2.Genom DNA yang
telah diisolasi dinilai apakah sudah terisolasi atau tidak dengan cara elektroforesis dan dibaca menggunakan Gel documentation.
Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya dengan menggunakan alat Maestro Nano Drops. Sampel diambil
sebanyak 1 μL, lalu diletakkan di lensa nano, ditutup dan di-analized. Hasil kemurnian dan
konsentrasi akan langsung terbaca dilayar dan tersimpan.
Tabel 3.2. Tahapan isolasi genom DNA Persiapan
Sampel Fresh Blood
1. Darah sebanyak 300 μl kedalam 1,5 ml tabung mikrosentrifugasi
dimasukkan 2.
900 μl RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan dikocok. 3.
Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan 4.
Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang.
5. 100 μl RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk meresuspensi
endapan leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis Langkah
1 Cell Lysis
6. 200 μl GB Buffer ditambahkan kedalam tabung tadi
7. Tabung diinkubasi pada suhu 60
o
C selama 10 menit untuk memastikan sampel terlisiskan.
8. Pada saat yang sama tabung lain berisi 50 μl Elution Buffer untuk
tiap satu sampel disiapkan, kemudian diinkubasi pada suhu 60
o
C. 9.
Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung didinginkan di suhu ruangan.
Langkah 2
DNA binding
10. 200 μl ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung tadi,
kemudian secara cepat dikocok selama 10 detik. 11.
GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan. 12.
Campuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD Column 13.
Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 5 menit 14.
Cairanpada 2 ml Collection Tube dibuang 15.
GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube Langkah
3 Wash
16. 400 μl W1 Buffer ditambahkan kedalam GD Column kemudian
disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
17. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang
18. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube
19. 600 μl Wash Buffer ditambahkan kedalam GD Column
20. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
21. Cairan pada 2 ml Collection Tube dibuang
22. GD Column ditempatkan kembali pada 2 ml Collection Tube
23. Tabung disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk
mengeringkan matriks kolum Langkah
4 DNA
Elution Standar volume elution buffer untuk 1 sampel
adalah 100 μl. Jika sampel yang digunakan dalam volume yang sedikit, volume elusi
sekitar 30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.
24. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi yang steril 25.
50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi ditambahkan ke dalam matriks kolom, dibiarkan selama 3 menit
26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
untuk mendapatkan hasil
3.5.3. Real Time PCR-HRM
