Polymorphisms SNPs, identifikasi varian gen baru tanpa sekuensing gene
scanning atau mendeterminasi variasi genetik pada populasi.
26
Langkah awal dari protokol HRM adalah amplifikasi area yang akan dianalisis dengan menggunakan teknik PCR standar sehingga terdapat double
stranded -DNA dsDNA yang dapat mengikat zat warna. Pewarna tersebut
memiliki daya floresensi yang tinggi saat berikatan dengan dsDNA dan sangat lemah pada daerah yang tidak berikatan.Perubahan ini memungkinkan pengguna
untuk memantau amplifikasi DNA selama PCR sebagai PCR kuantitatif.
26
Setelah langkah PCR selesai, target diperkuat secara bertahap dengan cara didenaturasi secara bertahap dengan meningkatkan suhu sedikit demi sedikit,
untuk menghasilkan profil karakteristik leleh; ini yang disebut sebagai Melting Analysis
. Target yang sudah diamplifikasi didenaturasi secara bertahap, melepaskan pewarna, yang menghasilkan penurunan fluoresensi.Ketika
pengaturan sudah tepat, HRM cukup sensitif untuk memungkinkan deteksi perubahan basa tunggal antara urutan nukleotida yang dinyatakan identik. HRM
menggunakan pewarna yang termasuk murah dan sedikit optimasi dibandingkan dengan sistem yang sama seperti Taqman dan Fluorescence Resonance Energy
Transfer FRET probes. Dibandingkan dengan metode tersebut, HRM lebih
sederhana dan lebih cost-effective untuk sampel yang banyak.
26
2.1.9.1 Analisis Hasil HRM
Dengan software Light Cycler 480 Roche yang benar, analisis data dapat dilakukan terhadap beberapa sampel secara simultan. Hal ini penting untuk
mengetahui apa yang harus dicari ketika menganalisis hasil; kesalahan tak terduga yang dilakukan selama pemasangan dapat diidentifikasi pada saat ini. Perubahan
melt plots yang rendah sering terlihat sebagai derivative plot -dF dT terhadap
T; Namun, data melting curve harus dianalisis secara berbeda. Bagian ini menjelaskan analisis hasil HRM dengan contoh produk 124 bp meliputi jenis IV
SNPrs641805. Masalah yang paling umumdihadapi dan solusi dari masalah tersebut akan dibahas.
26
a. Plot amplifikasi
Reproduksibilitas amplifikasi lebih penting pada analisis HRM daripada efisiensi amplifikasi dibandingkan dengan PCR kuantitatif. Misalnya, analisis
HRM masih bisa dilakukan jika produk amplifikasi lebih lambat daripada perkiraan yaitu karena keterbatasan dalam desain primer, asalkan semua sampel
konsisten.
26
b. Data mentah kurva leleh
Data yang dikumpulkan selama HRM yang dianalisis memiliki rentang awal pre-melt pembacaan fluoresensi. Variasi ini membuat sulit untuk
menganalisis hasil dengan benar, meskipun kelompok genotip yang berbeda dapat terlihat. Gambar 2.6 A menunjukkan bagaimana pemilihan daerah pre- dan post-
melt digunakan untuk menyelaraskan data. Pre- dan daerah post-melt harus dipilih
untuk setiap set primer, dengan posisi paralel ganda-bar seperti yang ditunjukkan. Hal ini penting untuk menyesuaikan bar ini sehingga wilayah lelehan tidak dipilih.
Jika pre- atau post- daerah leleh tidak jelas, mungkin untuk mengulang HRM menjalankan saja tanpa mengulangi langkah amplifikasi, dan menyesuaikan
kisaran suhu yang diperlukan.
26
c. Data Normalisasi
Jika data yang dinormalisasi benar, akan muncul seperti yang ditunjukkan pada gambar 2.6 B yang disebut data normalisasi. Pada gambar 2.6
B, variasi fluoresensi yang dapat dilihat pada gambar 2.6 A telah dihilangkan, dan hanya kisaran suhu antara bar luar daerah sebelum dan sesudah mencair
ditampilkan. Genotip sekarang lebih berbeda, tetapi dua sampel homozigot merah dan biru yang masih sulit untuk dibedakan.
26
d. Perbedaan grafik
Beberapa aplikasi perangkat lunak HRM memungkinkan perhitungan perbedaan alur. Hal ini didapatkan dengan mengurangi data fluoresensi
dinormalisasi dari genotip yang ditetapkan pengguna dari yang masing-masing sampel lainnya dalam analisis HRM. Pada gambar 2.6 C, genotip A A telah
dipilih sebagai dasar genotip apapun dapat dipilih, tetapi biasanya homozigot yang digunakan. Posisi masing-masing sampel relatif terhadap baseline memiliki
plot terhadap temperatur. Bentuk analisis HRM ini merupakan bantuan untuk
memvisualisasikan normalisasi data.
26
HRM memiliki sifat yang sangat sensitif sehingga desain uji nya sangat penting untuk dilakukan dengan baik. Perhatian khusus harus diberikan untuk
desain primer, reagen PCR yang digunakan dan kondisi siklus. Perbedaan pengaturan awal dapat sangat mempengaruhi hasil akhir. Faktor-faktor seperti
kualitas genom DNA, desain primer, dan konsentrasi MgCl
2
semua akan mempengaruhi hasil. Bagian berikut membahas masing-masing faktor-faktor yang
harus diperhatikan.
26
TT AA
AT
Gambar 2.6. Analisis data HRM dari SNP tipe 4 AT.A. Data mentah memperlihatkan pre-melt, melt dan post-melt. Memperlihatkan variasi fluoresensi
dan posisi pre dan post melting. B. Data normalisasi C. Grafik lain dari data normalisasi
Sumber :
https:www.kapabiosystems.comassetsIntroduction_to_High_Resolution_Melt_ Analysis_Guide.pdf
Kualitas dan kuantitas DNA merupakan salah satu faktor utama yang dapat mengurangi kualitas hasil. Hal tersebut dapat terjadi karena akumulasi dari
penyangga dari template DNA sampel atau pada saat proses persiapan. Pemurnian DNA yang tidak sesuai teknik dapat mempengaruhi hasil. Garam bisa
mempengaruhi proses melting produk PCR, dan dapat mengakibatkan sensitivitas rendah, reproduktifitas sedikit dan keluaran hasil genotip yang salah. Bufer yang
terakumulasi dari template DNA tidak hanya akan memodifikasi Tm, proses, melting
selama HRM, namun juga dapat mendorong amplifikasi yang spesifik selama PCR
26
. Untuk hasil yang optimal berikut dianjurkan beberapa hal dibawah ini:
• Idealnya, semua sampel DNA yang akan dianalisis termasuk genotype kontrol harus diekstrak menggunakan ekstraksi DNA dengan metode
atau kit yang sama. • Beberapa kit menggunakan konsentrasi tinggi garam untuk elusi DNA
dari kolom. Jadi, semua sampel template harus dielusi dengan kandungan rendah garam, idealnya 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
• Sampel DNA harus terkonsentrasi setelah pemurnian. Template kemudian dapat diencerkan dengan 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 sebelum
AA AT
TT
digunakan. Hal ini membantu untuk mengurangi variasi larutan penyangga antara sampel.
• Penambahan volume yang sedikit pada template DNA akan mengurangi akumulasi garam dalam reaksi; idealnya volume terendah
template yang dapat secara akurat ditambahkan harus digunakan 1-2
ml. • Semua sampel harus memiliki konsentrasi akhir DNA yang sama
disetiap uji. Tabel 2.4 menjelaskan rincian konsentrasi DNA yang dianjurkan untuk berbagai template. Pada template dengan konsentrasi
rendah, ada kesempatan yang lebih besar menggabungkan mutasi di awal PCR yang akan mempengaruhi perilaku melting; konsentrasi
tinggi DNA akan menghasilkan latar belakang fluoresensi yang tinggi karena meningkatnya interkalasi pewarna ke dalam dsDNA.
• Kontrol positif untuk semua genotip harus dimasukkan dan sebaiknya pada konsentrasi yang sama seperti sampel uji. DNA kontrol juga
harus dielusi danatau diencerkan dalam bufer yang sama sebagai sampel.
Tabel 2.4. Konsentrasi DNA yang dianjurkan untuk berbagai template Jenis DNA
Rekomendasi Konsentrasi DNA untuk analisis HRM
Genomic DNA gDNA 10 ng
– 100 pg Plasmid DNA 1-10kb
1 ng – 10 fg
Amplicon DNA 10 pg
– 1 fg
Sumber : https:www.kapabiosystems.comassetsIntroduction_to_High_Resolution _Melt_Analysis_Guide.pdf
2.2. Kerangka Teori
Gambar 2.7. Kerangka teori
