23. Tabung disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk
mengeringkan matriks kolum Langkah
4 DNA
Elution Standar volume elution buffer untuk 1 sampel
adalah 100 μl. Jika sampel yang digunakan dalam volume yang sedikit, volume elusi
sekitar 30 – 50 μl dapat meningkatkan konsentrasi DNA.
24. GD Column yang sudah kering dipindahkan ke dalam tabung
mikrosentrifugasi yang steril 25.
50 μl Elution Buffer yang sudah diinkubasi ditambahkan ke dalam matriks kolom, dibiarkan selama 3 menit
26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 x g selama 1 menit
untuk mendapatkan hasil
3.5.3. Real Time PCR-HRM
Setelah dilakukan isolasi genom DNA, pemeriksaan skrining dilakukan ketahap selanjutnya yakni Real Time PCR HRM dengan menggunakan alat Light
Cycler 480
®
04 909 631 001. Kondisi reaksi untuk amplifikasi dari sistem protokol untuk program High Resolution Melting adalah sebagai berikut.
Pre-inkubasi untuk aktivasi Fast Start Taq DNA Polimerase dan denaturasi template
Amplifikasi dari DNA target Melting dari amplikonuntuk peroleh data dengan resolusi tinggi
Pendinginan cooling dari kipas dan thermal chamber
Tabel 3.3 menunjukkan rekomendasi parameter yang digunakan dalam Real Time
PCR HRM sebagai gene scanning assay. Langkah memulai genotyping analisa:
1. Pengenceran primer
Sebanyak 5 μL primer forward dari tabung induk diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikro 1, kemudian
ditambahkan 5 μL dH
2
O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.
Lanjutan
Tabel 3.3. Parameter PCR yang direkomendasikan untuk Light Cycler 480
®
System PCR Run untuk membuat gene scanning assay dengan menggunakan
Light Cycler 480
®
High Resolution Melting Master
Sumber : http:sydney.edu.aumedicineboschfacilitiesmolecular-biologynucleicacidLightcycler 480GeneScanningSoftwareV1.5. pdf
Sebanyak 5 μL primer reverse dari tabung induk diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikro 2, kemudian ditambahkan 5
μL dH
2
O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi sebesar 50 μM.
Sebanyak 1 μL primer forward dan 1 μL primer reverse dari pengenceran
diatas 50 μM dipindahkan kedalam tabung mikro 3, kemudian
ditambahkan 8 μL dH
2
O. Hasil pengenceran didapatkan konsentrasi 5 μM, hasil ini yang digunakan dalam mix untuk
menjalankan RT PCR HRM. 2.
Pengenceran template DNA genom sampel DNA sampel induk yang telah diukur konsentrasinya, kemudian
diambil 1 sebanyak 1 μL dan ditambahkan 9 μL dH
2
O. Hasil ini yang digunakan sebagai template dalam menjalankan RT PCR
HRM. Setelah dilakukan langkah diatas, kemudian dipersiapkan mix untuk HRM
di dalam tabung yang berisi HRM kit 7,5 μL, MgCl
2
1,2 μL, primer campuran hasil pengenceran
0,75 μL, dan dH
2
O 1,8 μL. DNA sampel dari hasil pengenceran yang digunakan adalah sebanyak 3,75
μL. Kemudian DNA sampel dimasukkan terlebih dahulu kedalam sumur template PCR baru ditambahkan mix tadi
sebanyak 11,25 μL. Sumur ditutup dengan penutup plastiknya, kemudian
dimasukkan kedalam alat Light Cycler dan dijalankan.
3.5.4. Analisis Data
