3.7 Pengujian Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH
3.7.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kemampuan sampel uji dalam meredam proses oksidasi radikal bebas DPPH dalam larutan metanol sehingga terjadi perubahan warna DPPH dari ungu
menjadi kuning dengan nilai IC
50
konsentrasi sampel uji yang mampu meredam radikal bebas 50 sebagai parameter menentukan aktivitas antioksidan sampel
Molyneux, 2004.
3.7.2 Pembuatan larutan blanko
Larutan DPPH 0,5 mM konsentrasi 200 µgml dipipet sebanyak 5 ml, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda konsentrasi 40 µgml.
3.7.3 Pengukuran panjang gelombang serapan maksimum DPPH
Larutan DPPH konsentrasi 40 µgml dihomogenkan dan diukur serapannya pada panjang gelombang 400-750 nm yang merupakan panjang gelombang sinar
tampak Gandjar dan Rohman, 2007.
3.7.4 Pembuatan larutan induk 3.7.4.1 Pembuatan larutan induk sampel uji
Masing-masing sebanyak 1 g sari kental buah markisa ungu dan markisa konyal ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dilarutkan dengan
metanol lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda konsentrasi 20000 µgml.
Universitas Sumatera Utara
3.7.4.2 Pembuatan larutan induk vitamin C
Sebanyak 25 mg serbuk vitamin C ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml dilarutkan dengan metanol lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda konsentrasi 1000 µgml. 3.7.5 Pembuatan larutan uji
3.7.5.1 Larutan uji sari kental buah markisa ungu
Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan induk dipipet sebanyak 2,5 ml ; 5 ml ; 7,5 ml ; 10 ml ke dalam labu ukur 25 ml untuk
mendapatkan konsentrasi larutan uji 2000 µgml, 4000 µgml , 6000 µgml, 8000 µgml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5
mM konsentrasi 200 µgml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, diukur serapannya menggunakan
spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh.
3.7.5.2 Larutan uji sari kental buah markisa konyal
Konsentrasi ditetapkan setelah dilakukan beberapa orientasi. Larutan induk dipipet sebanyak 7,5 ml ; 10 ml ; 12,5 ml ; 15 ml ke dalam labu ukur 25 ml untuk
mendapatkan konsentrasi larutan uji 6000 µgml, 8000 µgml, 10000 µgml, 12000 µgml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH
0,5 mM konsentrasi 200 µgml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, diukur serapannya menggunakan
spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh.
Universitas Sumatera Utara
3.7.5.3 Larutan uji vitamin C
Larutan induk dipipet sebanyak 0,05 ml ; 0,1 ml ; 0,15 ml ; 0,2 ml ke dalam labu ukur 25 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 2 µgml, 4 µgml, 6
µgml, 8 µgml, ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM konsentrasi 200 µgml lalu volumenya dicukupkan dengan
metanol sampai garis tanda. Diamkan selama 60 menit, diukur serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Visibel pada panjang gelombang serapan
maksimum yang diperoleh.
3.7.6 Analisis persen pemerangkapan radikal bebas DPPH
Menurut Molyneux 2004, penentuan persen pemerangkapan radikal bebas oleh sampel uji, sari buah markisa ungu dan markisa konyal dengan vitamin C
sebagai pembanding, menggunakan metode pemerangkapan radikal bebas 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazil DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Q = 100 A -Ac A
Keterangan: Q = Persen pemerangkapan radikal bebas DPPH A
= Absorbansi tidak mengandung sampel
A
c
= Absorbansi sampel
3.7.7 Analisis nilai IC
50
Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas pemerangkapan radikal bebas adalah nilai IC
50
Inhibitory Concentration, nilai tersebut menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat memerangkap
radikal bebas sebesar 50 Molyneux, 2004. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan konsentrasi sari buah µgml sebagai absis
sumbu x dan nilai inhibisi antioksidan sebagai ordinatnya sumbu y.
Universitas Sumatera Utara
3.8 Pengukuran Kapasitas Antioksidan Total dengan Metode Pembentukan Kompleks Fosfomolibdenum
Metode pembentukan kompleks fosfomolibdenum merupakan metode yang digunakan untuk menentukan kapasitas antioksidan total yang dinyatakan sebagai
jumlah yang setara asam askorbat berdasarkan daya reduksi Mo VI menjadi Mo V oleh sampel analit dan selanjutnya pembentukan kompleks yang berwarna
hijau biru dari fosfat molibdenum yang mengandung antioksidan pada suasana asam Prieto., et al, 1999.
3.8.1 Pembuatan larutan induk baku vitamin C
Ditimbang vitamin C sebanyak 100 mg kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dan dilarutkan dengan akuades sampai garis tanda. Diperoleh
konsentrasi vitamin C pada Larutan Induk Baku LIB I adalah 1000 µgml.
3.8.2 Penentuan panjang gelombang maksimum
Dipipet 7 ml dari LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda konsentrasi 140 µgml.
Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi fosfomolibdenum. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan
ini adalah 12,727 µgml. Kemudian tabung ditutup, dipanaskan di penangas air selama 60 menit pada suhu 90ºC dan didinginkan pada suhu kamar. Kemudian
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400-750 nm.
3.8.3 Penentuan waktu kerja operating time
Dipipet 7 ml dari LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda konsentrasi 140 µgml.
Kemudian dipipet 0,5 ml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi ditambahkan 5 ml larutan pereaksi fosfomolibdenum. Diperoleh konsentrasi vitamin C pada larutan
Universitas Sumatera Utara
Kategori