d. Oxygen scavenger
Antioksidan dalam kelompok ini berfungsi mengikat oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi, misalnya vitamin C.
e. Chelators atau Sequesstrants
Antioksidan dalam kelompok ini berfungsi mengikat logam seperti besi dan tembaga yang mampu mengkatalis reaksi oksidasi lemak. Contohnya adalah
asam sitrat dan asam amino.
2.4.1 Antioksidan enzimatis
Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan utama primer terhadap kondisi stres oksidatif. Enzim-enzim tersebut merupakan metaloenzim yang
aktivitasnya sangat tergantung pada ion logam Winarsi, 2007. Antioksidan enzimatis yang dihasilkan tubuh antara lain SOD yang
mengubah superokisda O
2
•
−
yang reaktif menjadi hidrogen peroksida H
2
O
2
yang masih merupakan ROS namun kurang reaktif, sehingga dengan adanya enzim katalase akan merusak H
2
O
2
. Reaksi yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 2.1.
2O
2
•
−
+ 2H
+
superoksida dismutase
H
2
O
2
+ O
2
2H
2
O
2
catalase
2H
2
O + O
2
Gambar 2.1 Reaksi enzimatis destruksi superoksida
Antioksidan enzimatis lain dalam tubuh adalah molekul glutathione yang terdiri dari tiga buah asam amino yang bergabung membentuk tripeptida.
Glutathione biasa disingkat juga dengan GSH, yang bereaksi dengan hidrogen peroksida H
2
O
2
menghasilkan air dan glutathione dimer. Enzim yang bekerja pada reaksi ini adalah glutathione peroksidase. Glutathione dimer yang terbentuk
Universitas Sumatera Utara
GS-SG yang memiliki ikatan disulfida oleh enzim glutathione reduktase dan tambahan NADPH akan membentuk GSH kembali. Reaksi pemecahan H
2
O
2
oleh GSH dapat dilihat pada Gambar 2.2.
H
2
O
2
+ 2 GSH
Glutathione peroksidase
2H
2
O + GS-SG
Glutathione reduktase
Gambar 2.2 Reaksi peran protektif glutathione GSH Hanson, 2005
Antioksidan SOD bergantung pada logam Fe, Cu, Mn dan Zn. Beberapa makanan yang dapat meningkatkan produksi enzim ini adalah brokoli, kubis,
kubis tunas, dedak beras atau biji serealia dan kecambah gandum. Enzim katalase bergantung pada logam Fe yang dapat diperoleh dari sayuran hijau, kacang-
kacangan, hati, daging, telur, susu segar, tempe dan udang, sedangkan enzim glutathione peroksidase bergantung pada logam Se Selenium yang dapat
diperoleh dari asparagus, alpukat, ikan laut, cabai, paprika, seledri dan kacang- kacangan Lingga, 2012 ; Winarsi, 2007.
2.4.2 Antioksidan non-enzimatis
Selain antioksidan yang bersifat enzimatis, terdapat antioksidan non- enzimatis yang disebut juga antioksidan sekunder karena dapat diperoleh dari
asupan bahan makanan seperti vitamin A, C, E, beta karoten dan flavonoid. Senyawa-senyawa ini berfungsi memerangkap senyawa oksidan serta mencegah
terjadinya reaksi berantai Winarsi, 2007.
2.4.2.1 Vitamin C asam askorbat
Vitamin C atau asam askorbat mempunyai berat molekul 176,13 dengan rumus molekul C
6
H
8
O
6
. Pemerian vitamin C adalah hablur atau serbuk berwarna putih atau agak kekuningan. Pengaruh cahaya lambat laun menyebabkan berwarna
NADPH + H
+
NADP
+
Universitas Sumatera Utara
gelap, dalam keadaan kering stabil di udara namun dalam larutan cepat teroksidasi. Vitamin C mudah larut dalam air, agak sukar larut dalam etanol,
praktis tidak larut dalam kloroform, dalam eter dan dalam benzen Ditjen POM, 1979.
Sesuai dengan sifatnya yang larut dalam air, vitamin C bekerja melindungi bagian tubuh dari radikal bebas yang larut dalam air dengan mendonorkan
elektronnya ke dalam reaksi biokimia intraselluler dan ekstraselluler. Vitamin C mampu bereaksi dengan radikal bebas dan mengubahnya menjadi radikal askorbil
yang kurang reaktif, kemudian membentuk asam monodehidroaskorbat dan atau asam dehidroaskorbat. Bentuk tereduksi ini dapat diubah kembali menjadi asam
askorbat oleh enzim monodehidroaskorbat reduktase dan dehidroaskorbat reduktase Packer, 2002.
Asupan vitamin C sebaiknya 60-1000 mg per hari. Konsumsi terlalu banyak dikhawatirkan dapat mempengaruhi atau merusak nutrien lain di dalam tubuh.
Peneliti lainnya menyarankan mengasup 500 mg vitamin C dua kali sehari untuk mempertahankan tingkat optimal kebutuhan antioksidan. Vitamin C terdapat pada
buah-buahan seperti jeruk, apel, sirsak, lemon, stroberi, melon serta sayuran seperti tomat, sayuran berdaun hijau, brokoli, kembang kol Kosasih, 2004.
Rumus bangun vitamin C dapat dilihat pada Gambar 2.3.
Gambar 2.3 Rumus bangun vitamin C Shahidi, 2005
Universitas Sumatera Utara
2.4.2.2 Flavonoid
Senyawa flavonoid merupakan salah satu senyawa polifenol terbesar yang mengandung 15 atom karbon dalam inti dasarnya, yang tersusun dalam
konfigurasi C
6
– C
3
– C
6 ,
yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh
satuan 3 karbon Markham, 1988.
Flavonoid adalah antioksidan eksogen yang telah dibuktikan bermanfaat dalam mencegah kerusakan sel akibat stres oksidatif. Mekanisme kerja dari
flavonoid sebagai antioksidan secara langsung adalah dengan mendonorkan ion hidrogen sehingga dapat menetralisir efek toksik dari radikal bebas dan
mekanisme flavonoid sebagai antioksidan secara tidak langsung yaitu dengan meningkatkan ekspresi gen antioksidan endogen melalui aktivasi nuclear factor
erythroid 2 related factor 2 Nrf2 sehingga terjadi peningkatan gen yang berperan dalam sintesis enzim antioksidan endogen misalnya gen SOD
Sumardika dan I Made Jawi, 2012. Hampir 80 dari total antioksidan dalam buah dan sayuran berasal dari
flavonoid yang dapat berfungsi sebagai penangkap anion superoksida, lipid peroksida radikal, oksigen singlet, dan pengkelat logam Kosasih, 2004.
2.4.2.3 Beta karoten
Beta karoten atau disebut provitamin A merupakan salah satu dari karoten yang paling banyak terdapat pada jaringan tanaman. Beta karoten yang masuk ke
dalam mukosa usus kecil akan dipecah oleh enzim beta karoten 15,15’- monooxygenase menjadi retinol vitamin A. Satu molekul beta karoten akan
dipecah menjadi dua molekul retinol. Sebagian karoten disimpan di hati dalam bentuk pro-vitamin A dan sebagian yang lain diubah menjadi vitamin A. Vitamin
Universitas Sumatera Utara
A merupakan bentuk yang siap diabsorpsi oleh tubuh. Kemampuan usus untuk menyerap beta karoten berkisar 9-22 bergantung sumber dan bentuk beta
karoten yang akan diserap, ketersediaan lemak sebagai pelarutnya, dan kemampuan usus dari masing-masing individu.
Beta karoten bersifat larut dalam lemak sehingga melindungi sel dari kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas yang larut dalam lemak.
Kemampuannya dalam menjaga integritas sel sangat baik sehingga dapat berperan sebagai antioksidan Lingga, 2012. Rumus bangun betakaroten dapat dilihat pada
Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Rumus bangun betakaroten Hanson, 2005.
2.5 Metode pemerangkapan radikal bebas DPPH 1,1
-diphenyl-2- picrylhydrazil
Metode pemerangkapan radikal bebas DPPH diperkenalkan 50 tahun yang lalu oleh Marsden Blois. Sebagai sampel uji antioksidan, Blois menggunakan asam
amino sistein yang mengandung gugus thiol. Ketika larutan DPPH dicampurkan dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, akan dihasilkan bentuk
tereduksi dari DPPH dan berkurangnya warna ungu Molyneux, 2004. Berikut ini adalah reaksi pemerangkapan radikal bebas DPPH Gambar 2.5.
Universitas Sumatera Utara
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine
Gambar 2.5 Reaksi antara DPPH dengan atom H dari senyawa antioksidan
Widyastuti, 2010 Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak mahal
untuk mengukur kemampuan dari berbagai senyawa dalam memerangkap radikal bebas dan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan pada makanan dan minuman
Marinova, 2011. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah harga
konsentrasi efisien atau Efficient Concentration EC
50
atau Inhibitory Concentration IC
50
yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50 DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat
antioksidan yang memberikan persen penghambatan sebesar 50. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi akan memiliki harga EC
50
atau IC
50
yang rendah. Metode ini akan memberikan hasil yang baik dengan menggunakan
pelarut metanol atau etanol karena kedua pelarut ini tidak mempengaruhi dalam reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas
Molyneux, 2004.
Universitas Sumatera Utara
2.6 Metode pembentukan kompleks fosfomolibdenum
Metode ini diperkenalkan oleh Chipault et al. pada tahun 1955 untuk mengidentifikasi kapasitas antioksidan alami yang larut dalam air dan larut dalam
lemak. Metode ini merupakan metode kuantitatif yang didasarkan pada reduksi Mo VI menjadi Mo V oleh sampel analit diikuti dengan pembentukan
kompleks fosfat Mo V berwarna hijau untuk mengidentifikasi adanya agen pereduksi. Konsentrasi diperoleh secara spektrofotometri dan hasil yang diperoleh
diekspresikan dalam bentuk ekuivalen terhadap asam askorbat atau α-tokoferol. Metode pembentukan kompleks fosfomolibdenum merupakan metode
alternatif untuk evaluasi kapasitas antioksidan total lainnya karena metode ini sederhana dan pereaksinya murah Prieto et al., 1999.
2.7 Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometri adalah pengukuran absorbsi energi cahaya oleh suatu atom atau molekul pada panjang gelombang tertentu. Daerah spektrum ultraviolet
biasanya dianggap berkisar dari 200 hingga 400 nm dan daerah sinar tampak dari 400 hingga 750 nm.
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometer ultraviolet dan sinar tampak yaitu:
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Cara yang digunakan adalah dengan merubahnya menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu sehingga dapat menyerap sinar UV-Vis.
b. Waktu kerja operating time
Tujuannya ialah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dan absorbansi larutan.
Universitas Sumatera Utara
c. Pemilihan panjang gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
d. Pembuatan kurva kalibrasi
Dilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi kemudian absorbansi tiap konsentrasi diukur lalu dibuat kurva yang merupakan
hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. e.
Pembacaan absorbansi sampel Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai
0,8 Gandjar dan Abdul, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental, meliputi identifikasi bahan tumbuhan, pengumpulan bahan tumbuhan, pembuatan sari buah markisa
ungu dan sari buah markisa konyal segar, skrining fitokimia sari segar dan kental buah markisa ungu dan markisa konyal, identifikasi vitamin C sari kental buah
markisa ungu dan markisa konyal. Pengujian aktivitas antioksidan sari buah markisa ungu dan sari buah markisa konyal dengan metode pemerangkapan
radikal bebas 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl DPPH serta pengukuran kapasitas antioksidan total dengan metode pembentukan kompleks fosfomolibdenum yang
diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visible.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari alat-alat gelas laboratorium, spektrofotometer UV-Visible Shimadzu 1800, freeze dryer Virtis
Benchtop K, neraca analitis Boeco Germany, penangas air Stuart-SBS40, ultrasonikator Bronson 1510, cawan porselin, desikator, saringan, spatula,
stopwatch.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah markisa ungu segar dan buah markisa konyal segar. Bahan-bahan kimia lainnya yang berkualitas pro
analisis adalah DPPH Sigma, vitamin C CSPC Welsheng Pharmaceutical Co., Ltd., produksi E-Merck yaitu metanol, kloroform, isopropanol, benzen, n-heksan,
asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, raksa II klorida,
Universitas Sumatera Utara
bismuth III nitrat, besi III klorida, timbal II asetat, kalium iodida, iodium, α- naftol, asam asetat anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol, serbuk
magnesium Mg, perak II nitrat, kupri II sulfat, kalium natrium tartrat, larutan ammonia encer, ammonium molibdat, natrium fosfat dan air suling teknis.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, pembuatan sari buah markisa ungu dan sari buah markisa
konyal segar, pengentalan sari buah markisa ungu dan sari buah markisa konyal segar dengan menggunakan freeze dryer.
3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Metode pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan bahan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan
tumbuhan yang digunakan adalah buah markisa ungu segar dan buah markisa konyal segar, diperoleh dari Pasar Tradisional Pringgan, Jalan Iskandar Muda,
Medan Baru, Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
