Identifikasi Bakteri : Etichal Clearance dan Informed Consent Rencana Pengolahan dan Analisis Data

Panel phoenix terdiri dari 51 sumur pada bagian ID serta 85 sumur pada bagian AST. Bagian ID terdiri dari 45 sumur dengan substrat biokimia yang dikeringkan serta 2 sumur berfluoresens sebagai kontrol. Bagian AST terdiri dari dari 84 sumur yang berisi agen antimikroba yang dikeringkan dan 1 sumur sebagai kontrol pertumbuhan. Panel ini tersedia dalam bentuk hanya bagan ID saja, AST saja ataupun kombinasi keduanya. Sumur-sumur yang tidak terpakai dapat digunakan kemudian hari. Panel-panel phoenix terdiri dari media inokulum yang terstandarisasi. Suspensi organisme harus dipersiapkan dengan BBL CrystalSpec TM nephelometer, BD PhoenixSpec TM nephelometer, atau BD Phoenix TM AP Instrumen. Setelah diinokulasi, panel diletakkan pada instrumen dan secara kontiniu diinkubasi pada suhu 35 o C. Instrumen akan menguji tiap-tiap panel. Panel-panel phoenix hanya bisa dibaca oleh instrumen. Panel-panel phoenix tidak dapat dibaca secara manual.

a. Identifikasi Bakteri :

Bagian ID pada panel phoenix menggunakan serangkaian kromogenik konvensional dan uji biokimia fluorogenik untuk menentukan identifikasi organisme. Kerja media pertumbuhan dan substrat enzimatik meliputi pengenalan terhadap jenis-jenis reaktivitas yang berbeda dalam ruang taksa. Uji-uji tersebut didasarkan pada utilisasi dan degradasi mikrobial terhadap substrat spesifik yang dideteksi oleh bermacam indikator yang berbeda. Produksi asam ditandai oleh perubahan indikator fenol merah. Hal ini terjadi jika isolat mampu mengutilisasi substrat karbohidrat. Universitas Sumatera Utara Substrat kromogenik menghasilkan warna kuning ketika terjadi hidrolisis enzimatik terhadap campuran p-nitrophenyl atau p-nitroanilide. Hidrolisis enzimatik substrat fluorogenik ini menghasilkan pelepasan derivat coumarin berfluoresence. Organisme yang mengutilisasi sumber karbon yang spesifik dapat mengurangi indikator yang berbasis resazurin. Sebagai tambahan, terdapat beberapa uji-uji lain yang dapat mendeteksi kemampuan organisme untuk menghidrolisis, mendegradasi, mereduksi atau menggunakan substrat dengan cara lainnya.

b. Uji Sensitivitas Antimikroba :

Metode AST phoenix merupakan uji mikrodilusi berbasis kaldu. Sistem phoenix menggunakan indikator redoks untuk mendeteksi pertumbuhan organisme dengan keberadaan agen antimiroba. Pemeriksaan yang berkelanjutan terhadap perubahan pada indikator dan kekeruhan bakteri digunakan untuk menentukan pertumbuhan bakteri. Setiap konfigurasi panel AST teridiri dari beberapa agen antimikroba dengan ruang lingkup yang luas dari dua kali lipat konsentrasi dilusi. Identifikasi organisme digunakan dalam interpretasi nilai –nilai MIC dari tiap agen antimikroba dalam klasifikasi sensitif, intermediate atau resisten SIR. Persyaratan inokulasi koloni bakteri pada panel Phoenix;  Koloni harus murni  Dari pewarnaan Gram diketahui jenis bakterinya apakah bakteri Gram Positif atau bakteri Gram Negatif. Pada penelitian ini dipilih bakteri Gram Negatif Universitas Sumatera Utara Persiapan reagen : Panel Phoenix; NMICID untuk bakteri Gram negatif, penutup panel, Phoenix ID Broth, Phoenix AST Broth, Phoenix AST indicator solution, Phoenix Inoculation Station, Phoenix Panel Caddy, Phoenix SpecNephelometer, tabung kalibrasit, pipette 25 L dan 50 L, dan Vortex Prosedur pengerjaan 1. Siapkan inokulum, usia isolat antara 18-24 jam 2. Beri label pada tabung ID broth dan panel jangan memberi label pada barcode 3. Secara teknik aseptik, pilih koloni dengan dengan sterile cotton swab dari media pertumbuhan. Jangan gunakan polyester atau calcium alginate swab 4. Masukkan dan larutkan koloni ke dalam ID broth. 5. Tutup tabung dan vortex selama 5 detik. 6. Diamkan selama 10 detik untuk menghilangkan gelembung udara tabung dapat dijentikkan juga untuk menghilangkan gelembung udara 7. Gunakan PhoenixSpec Nephelometer untuk mengukur kekeruhan; standar yang digunakan; 0,50 – 0,60 McFarland untuk Gram Negatif 8. Jika kekeruhan sample lebih tinggi dari standar yang ditetapkan. Lakukan langkah berikut untuk mengencerkannya. a. Gunakan spidol untuk menandai isi awal tabung ID broth. Universitas Sumatera Utara b. Dengan menggunakan pipet steril, secara aseptic tambahkan ID broth baru ke dalam tabung inokulum ID broth. Hanya gunakan ID broth, jangan gunakan larutan selain ID broth. c. Vortex tabung. d. Ukur kekeruhan dengan PhoenixSpec. Jika masih terlalu keruh tambahkan lagi dengan ID broth dan vortex ulang 9. Setelah kekeruhan sesuai dengan standar McFarland, gunakan pipet steril dan secara aseptik buang kelebihan larutan broth sampai dengan tanda awal. 10. Siapkan AST inokulum a. Tambahkan 1 tetes AST indicator solution ke dalam Phoenix AST Broth. b. Goyang dengan membolak-balikan tabung AST broth beberapa kali sampai tercampur. Jangan di vortex. c. Jika kekeruhan yang dipakai 0,50 – 0,60 McFarland, transfer 25 L larutan dari ID broth ke AST broth. d. Jika kekeruhan yang dipakai 0,20 – 0,30 McFarland, transfer 50 L larutan dari ID broth ke AST broth. e. Tutup tabung AST broth dan bolak-balikan beberapa kali. Jangan di vortex. 11. Siapkan Panel a. Tempatkan panel pada inoculation station. Universitas Sumatera Utara b. Tempatkan ID broth pada kiri Inoculation station dan AST Broth di sebelah kanannya. c. Tuangkan masing-masing tabung ke panel sesuai dengan peruntukannya. d. Tutup panel dengan plastik penutup 12. Secara visual amati jika lubang pada panel sudah terisi sempurna dan hindari jika ada gelembung. 13. Tempatkan panel Phoenix yang telah diinokulasikan di Panel Transport Caddy untuk dimasukkan ke dalam mesin Phoenix. 14. Cek kemurnian dapat dilakukan dengan menginokulasikan 1 tetes ID broth ke Agar darah yang kemudian diinkubasikan di suhu 35  C selama 18-24 jam.

3.8.4 Memasukkan Panel yang telah diinokulasi koloni bakteri ke dalam Mesin Phoenix

Panel yang telah diinokulasi koloni bakteri harus dimasukkan ke mesin Phoenix dalam waktu 30 menit Prosedur Pengerjaan 1. Panel Login a. Tekan Panel Login atau scan panel pada tempat scan barcode Universitas Sumatera Utara b. Pada bagian Sequence, jika belum terisi ketikan angka yang terdapat di bagian barcode panel. c. Pada bagian Accesion , ketikan dengan format sebagai berikut;  Untuk ..... di isi dengan ....  Untuk .... di d. Tekan tombol Save 2. Memasukkan panel ke instrument a. Tekan Load Panel b. Tunggu sampai keluar gambar kunci terbuka c. Buka pintu mesin Phoenix d. Masukkan panel pada holder panel yang tidak ada tanda LED yang menyala. Cara memasukkan panel dapat dilihat pada gambar berikut ini. Universitas Sumatera Utara 3. Tutup pintu setelah panel dimasukkan ke mesin Phoenix

3.8.5. Mengeluarkan panel dari mesin Phoenix

Saat sistem mesin selesai, panel yang telah selesai dan mengeluarkan hasil, harus difinalisasi terlebih dahulu. Setelah proses finalisasi, panel dapat dikeluarkan. Prosedur Pengerjaan 1. Tekan Unload Panel 2. Ketika tanda kunci terbuka muncul, buka pintu mesin Phoenix 3. Semua panel yang bisa dikeluarkan diindikasi dengan nyala Led berwarna hijau 4. Keluarkan panel dengan menekan sedikit panel ke bawah, tarik bagian atas dan keluarkan panel dari tempatnya. 5. Jika masih ada panel pada tempat yang tidak bisa dijangkau, tutup pintu terlebih dahulu sampai instrumen mereposisi panel ke tempat yang bisa dijangkau. Ketika tanda ’kunci terbuka’ muncul, buka pintu dan keluarkan kembali panel. 6. Buang panel ke biohazard container.

3.8.6. Interpretasi hasil

 Identifikasi organisme akan muncul pada Phoenix Report Form sesuai dengan database Phoenix berdasarkan reaksi profil substrat. Universitas Sumatera Utara  Hasil Tes Kepekaan Antibiotik akan dikeluarkan sesuai dengan standar MIC yang dikeluarkan oleh CLSI, dengan kategori Sensitif dan Resisten  Jika hasilnya adalah organisme penghasil ESBL, maka akan muncul di bagian Resistance Marker

3.9 Pemantapan Kualitas

3.9.1. Pemantapan Kualitas Media Kultur

Stamm kuman yang telah diketahui dan sampel ditanam pada media yang sesuai untuk mengontrol media-media yang baru dibuat dan membandingkan morfologi koloni yang tumbuh. Pemilihan stamm kuman berdasarkan media yang akan dilakukan terhadap pemeriksaan tersebut. 1. Kuman Escherichia coli ditanamkan pada agar Mac Conkey inkubasi 18-24 jam dan dilihat hasilnya. 2. Kuman Staphylococcus aureus ditanamkan pada agar darah dan diinkubasi selama 18-24 jam dan lihat hasilnya . Pemantapan kualitas media kultur dilakukan setiap media dibuat.

3.9.2. Pemantapan Kualitas Pewarnaan

Dilakukan pewarnaan terhadap stamm kuman untuk gram positif berwarna ungu misalnya staphylococcus aureus bentuk koloni mnyerupai buah anggur dan Gram negatif berwarna merah misalnya Klebsiella pneumone dan E. coli. Pemantapan kualitas Gram dilakukan setiap hari saat akan memulai melakukan pemeriksan pewarnaan Gram. Universitas Sumatera Utara

3.9.3. Pemantapan Kualitas BD Phoenix

Dalam rangka memastikan set yang tepat sampai prosedur dan kinerja yang dapat diterima dari sistem Panel Phoenix, maka sesuai dengan anjuran dari BD Phoenix sendiri, pada penelitian ini dilakukan pemantapan kualitas dengan menggunakan stamm kuman Escherichia coli ATCC™ 25922. Stamm kuman tersebut dilakukan untuk memastikan bahwa ID NMICID and NID panels dan AST NMICID, NMIC panels bisa digunakan. Pemantapan kualitas dilakukan saat set Panel Phoenix diterima, lalu diambil satu panel secara acak dari seri paket panel phoenix untuk kemudian diuji dengan stamm kuman Escherichia coli ATCC™ 25922. Jika setelah kuman Escherichia coli ATCC™ 25922 ditanam pada panel dan kemudian sistem BD Phoenix mengidentifikasinya juga sebagai Escherichia coli, maka kontrol dinyatakan masuk atau diterima. Artinya panel BD Phoenix akan mampu mengidentifikasi setiap kuman gram negatif yang ditanam pada panel tersebut.

3.10. Etichal Clearance dan Informed Consent

Ethical clearance diperoleh dari Komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Pada penelitian informed consent diberikan pada penderita yang hasil kultur dari spesimennya diidentifikasikan sebagai E. coli atau K. pneumonia penghasil ESBL dan yang non-ESBL. Setelah penelitian selesai, spesimen dimusnahkan sesuai dengan standar prosedur yang berlaku di Laboratorium Universitas Sumatera Utara Mikrobiologi Departemen Patologi Klinik FK USURSUP H. Adam Malik Medan.

3.11. Rencana Pengolahan dan Analisis Data

Analisa data dilakukan menggunakan software SPSS Statistical Package for Social Sciences, Chicago, IL, USA 20.0 untuk Windows. Untuk melihat ada tidaknya hubungan setiap faktor resiko dengan kejadian infeksi ESBL pada E.coli atau K. pneumonia digunakan cara Chi Square.

3.12 Perkiraan Biaya Penelitian