Jenis dan Rancangan Penelitian Tata cara hasil

21

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian mengenai efek hepatoprotektif pemberian jangka panjang infusa daun Sonchus arvensis L., terhadap aktivitas serum ALT- AST pada tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

Variabel-variabel yang digunakan pada percobaan ini adalah sebagai berikut:

1. Variabel penelitian

a. Variabel utama 1 Variabel bebas Variabel bebas penelitian ini adalah dosis infusa daun Sonchus arvensis L. yang dibuat dalam tiga peringkat dosis. Dosis infusa daun Sonchus arvensis L. adalah volume ml infusa daun Sonchus arvensis L. tiap satuan kg berat hewan uji yang bersangkutan. 2 Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah aktivitas ALT-AST serum pada tikus jantan yang terinduksi karbon tetraklorida CCl 4 setelah pemberian infusa daun Sonchus arvensis L. b. Variabel pengacau 1 Variabel pengacau terkendali a. Kondisi hewan uji, yaitu menggunakan tikus berjenis kelamin jantan, dengan galur Wistar, berat badan 150-250, umur 2-3 bulan. b. Frekuensi pemberian infusa daun Sonchus arvensis L. di berikan satu kali selama 6 hari berturut-turut. c. Cara pemberian senyawa uji dilakukan secara peroral dan pemberian hepatotoksin karbon tetraklorida diberikan secara intraperitoneal. d. Bahan uji yang digunakan berupa daun Sonchus arvensis L. yang diambil dari Wonosari, Daerah Istimewa Yogyakarta pada bulan Januari 2015. 2 Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah kondisi patologis dari hewan uji.

2. Definisi operasional

Definisi operasional penelitian ini adalah sebagai berikut. a. Daun Sonchus arvensis L. Daun Sonchus arvensis L. yang diambil dari daun Sonchus arvensis L. adalah yang berwarna hijau, segar dan disekitarnya terdapat kuncup bunga dari daun Sonchus arvensis L. tersebut. b. Infusa daun Sonchus arvensis L. Infusa daun Sonchus arvensis L. didapatkan dengan cara menginfundasi 15 g serbuk kering daun Sonchus arvensis L. dalam 100 mL air pada suhu 90 °C selama 15 menit sehingga diperoleh konsentrasi infusa daun Sonchus arvensis L. adalah 15. c. Efek hepatoprotektif Efek hepatoprotektif merupakan kemampuan infusa daun Sonchus arvensis L. dengan dosis tertentu yang diberikan selama satu kali sehari selama 6 hari secara peroral yang melindungi hati dengan cara menurunkan aktivias ALT- AST pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida. Menurut Wakchaure, Jain, Singhai and Somani 2011, mengatakan bahwa apabila persen efek hepatoprotektif mendekati 0 maka akan menimbulkan efek hepatotoksin. Sedangkan apabila persen efek hepatoprotektif mendekati 100 maka semakin besar efek hepatoprotektifnya. d. Jangka panjang Penelitian ini dilakukan dengan memberi infusa daun Sonchus arvensis L. satu kali sehari selama 6 hari secara peroral.

C. Bahan Penelitian 1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan adalah tikus jantan, umur 2-3 bulan dengan berat badan berkisar antara 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji berupa daun Sonchus arvensis L. yang diambil dari Wonosari, Daerah Istimewa Yogyakarta.

2. Bahan kimia a. Hepatotoksin

Karbon Tetraklorida Merck ® yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Kontrol negatif Olive oil yang diperoleh dari PT. Brataco Chemika, Yogyakarta. berperan sebagai kontrol negatif. c. Pelarut untuk infusa Aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Pelarut untuk hepatotoksin Olive oil yang diperoleh dari PT. Brataco Chemika, Yogyakarta. berperan sebagai pelarut karbon tetraklorida. e. Blanko Aquabidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. f. Reagen ALT Reagen yang digunakan adalah reagen ALT DiaSys. Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut Tabel III. Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen ALT Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7,15 140 mmolL L-Alanine 700 mmolL LDH lactate dehydrogenase ≥2300 UL R2 : 2-Oxoglutarate 85 mmolL NADH 1 mmolL Pyroxidal-5 phospate FS: Good’s buffer Pyridoxal-5-phosphate 9,6 100 mmolL 13 molL

g. Reagen AST

Reagen yang digunakan adalah reagen ALT DiaSys. Komposisi dan konsentrasi dari reagen AST adalah sebagai berikut Tabel IV. Tabel IV. Komposisi dan konsentrasi reagen AST Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7,15 140 mmolL L-Aspartate 700 mmolL MDH malate dehydogenase ≥800 UL LDH lactate dehydrogenase ≥1200 UL R2 : 2-Oxoglutarate 65 mmolL NADH 1 mmolL Pyroxidal-5 phospate FS: Good’s buffer Pyridoxal-5-phosphate 9,6 100 mmolL 13 molL

D. Alat Penelitian 1.

Alat preparasi dan pembuatan infusa daun Sonchus arvensis L. Moisture balance , cawan porselen, panci infundasi, termometer, stopwatch , gelas Beaker, gelas ukur, batang pengaduk, penangas air, timbangan analitik, dan kain flanel.

2. Alat pengujian hepatoprotektif

Gelas Beaker, gelas ukur, tabung reaksi, labu ukur, tabung reaksi, pipet tetes, batang pengaduk Pyrex Iwaki Glass ® , timbangan analitik Mettler Toledo ® , vortex Genie Wilten ® , spuit injeksi peroral untuk tikus, spuit injeksi intraperitoneal , pipa kapiler, tabung Eppendorf, sentrifuge, Micro-Vitalab 200 Merck ® , blue tip, dan yellow tip.

E. Tata cara penelitian 1. Determinasi tanaman Sonchus arvensis L.

Determinasi tanaman Sonchus arvensis L. dilakukan dengan metode perbandingan untuk megetahui apakah tanaman yang digunakan adalah benar Sonchus arvensis L., yaitu dengan mencocokkan ciri-ciri tanaman Sonchus arvensis L. yang diperoleh dari Wonosari, Daerah Istimewa Yogyakarta dengan tanaman kering daun Sonchus arvensis L. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi tanaman Sonchus arvensis L. menggunakan buku acuan karangan Van Steeni 1981 hingga tingkat spesies. Bagian tanaman yang dideterminasi antara lain batang, daun, biji, dan bunga.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang akan dibuat menjadi serbuk adalah daun Sonchus arvensis L. yang masih segar dan berwarna hijau. Daun Sonchus arvensis L. diambil dari awal pertumbuhan bahan berumur 1 bulan hingga saat menjelang berbunga berumur 1,5 bulan. Daun Sonchus arvensis L. dipanen dari Wonosari, Daerah Istimewa Yogyakarta pada musim penghujan.

3. Pembuatan serbuk daun Sonchus arvensis L.

Daun Sonchus arvensis L. dicuci dengan air mengalir hingga bersih dan diangin-anginkan hingga kering. Pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 50 o C selama 48 jam. Setelah benar-benar kering, daun Sonchus arvensis L. diserbuk dengan alat penyerbuk dan diayak dengan ayakan mesh nomor 40 untuk mendapatkan serbuk daun Sonchus arvensis L. yang lebih halus dan ukuran pertikelnya seragam.

4. Penetapan kadar air serbuk kering daun Sonchus arvensis L.

Penetapan kadar air bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk daun Sonchus arvensis L. dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik. Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Gravimetri dengan menggunakan alat moisture balance. Sebanyak 5 g kemudian dimasukan kedalam alat dan diratakan. Bobot serbuk kering daun tersebut ditetapkan sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu, serbuk dipanaskan pada suhu 105 o C selama 15 menit. Serbuk kering daun Sonchus arvensis L. ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A terhadap bobot B yang merupakan kadar air daun Sonchus arvensis L. Pengaturan suhu 105 o C selama 15 menit dilakukan untuk menguapkan kandungan air agar diperoleh nilai hasil pengukuran serbuk daun Sonchus arvensis L. kemudian hasil tersebut dilihat apakah telah memenuhi persyaratan strandarisasi non-spesifik dan memenuhi syarat serbuk yang baik dengan kadar air kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995.

5. Pembuatan infusa daun Sonchus arvensis L.

Sebanyak 15 g serbuk yang sudah halus dimasukkan ke dalam panci infusa kemudian ditambahkan 100 mL, panaskan di atas penangas air selama 15 menit terhitung mulai suhu mencapai 90 o C sambil sekali-sekali diaduk-aduk. Saring selagi panas melalui kain flanel, tambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa yang dikehendaki Badan Pengawasan Obat dan Makanan, 2010.

6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50

Berdasarkan penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, larutan karbon tetraklorida dibuat dengan konsentrasi 50 dengan perbandingan volume karbon tetraklorida dan pelarut, yakni 1:1. Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan melarutkan karbon tetraklorida ke dalam olive oil yang memiliki volume yang sama. 7. Penetapan dosis infusa daun Sonchus arvensis L. Dasar penetapan peringkat dosis adalah bobot tertinggi tikus dan pemberian cairan secara peroral separuhnya, yaitu 2,5 ml. Penetapan dosis tertinggi infusa daun Sonchus arvensis L. adalah: D x BB = C x 12V D x BB tertinggi tikus kgBB = C infusa mgml x 2,5 ml D = x gkgBB Dua dosis lainnya diperoleh dengan menurunkan 2 kalinya dari dosis tertinggi. 8. Uji pendahuluan a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida Penetapan dosis hepatotoksin dilakukan melalui studi literatur yang dilakukan oleh Janakat dan Al-Merie 2002 yang menyebutkan bahwa dosis hepatotoksin karbon tetraklorida yang digunakan untuk menginduksi kerusakan hati tikus jantan galur Wistar adalah 2 mLkgBB di mana volume CCl 4 sama dengan volume olive oil, yaitu 1:1. Pemilihan dosis hepatotoksik ini karena pada dosis tersebut, terjadi kerusakan sel-sel hati dari tikus jantan galur Wistar yang terdeteksi dari kenaikan serum ALT dan AST, namun tidak sampai menyebabkan kematian pada tikus jantan sebagai subjek penelitian tersebut Janakat, Al-Merie, 2002. b. Penetapan waktu pencuplikan darah Waktu pencuplikan darah diperoleh dengan cara melakukan orientasi dengan tiga kelompok perlakuan waktu, yakni pada waktu ke- 0, 24, dan 48 jam. Kemudian diukur kenaikan aktivitas ALT dan AST. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Janakat dan Al-Merie 2002 telah menunjukkan bahwa terdapat peningkatan aktivitas ALT pada tikus yang terinduksi karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil dengan perbandingan 1:1, yakni dengan dosis 2 mLkgBB. Peningkatan aktivitas maksimal terjadi pada jam ke-18 dan jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida secara injeksi dan kemudian berangsur menurun pada jam ke-48 dan terjadi perbaikan sel hati setelah tiga hari pemberian hepatotoksin Janakat, Al-Merie, 2002.

9. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji

Tikus jantan galur Wistar yang diperlukan sebagai hewan uji adalah sebanyak 30 ekor yang kemudian akan dibagi kedalam 6 kelompok secara acak sama banyak. Kelompok I kelompok kontrol hepatotoksin diberi larutan karbon tetraklorida dalam olive oil 1:1 dengan dosis 2 mLkgBB secara intraperitoneal. Kelompok II kelompok kontrol olive oil kontrol negatif diberi olive oil dengan dosis 2 mLkgBB secara intraperitoneal. Kelompok III kelompok kontrol infusa yakni diberi infusa daun Sonchus arvensis L. dengan dosis 1,5 gkgBB secara peroral Alkreathy et al., 2014. Kelompok IV-VI kelompok perlakuan uji yang diberikan infusa daun Sonchus arvensis L. dengan dosis bertingkat yakni 0,375; 0,75; 1,5 gkgBB satu kali sehari selama 6 hari, selanjutnya pada hari ke-7 diinduksi dengan karbon tetraklorida dengan dosis 2 mLkgBB Alkreathy et al., 2014. Dilakukan pengambilan darah pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas ALT dan AST pada jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida.

10. Pembuatan serum

Darah yang diambil dari sinus orbitalis mata tikus kemudian ditampung dalam tabung Eppendorf dan didiamkan selama 15 menit, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit lalu diambil supernatannya menggunakan mikro pipet dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang berbeda. Selanjutnya supernatan tersebut disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Lapisan supernatannya diambil menggunakan mikro pipet untuk kemudian diukur aktivitas ALT dan AST.

11. Pengukuran aktivitas ALT dan AST

Alat yang digunakan untuk pengukuran aktivitas ALT-AST adalah Micro-Vitalab 200. Tahap analisis ALT dan AST dilakukan dengan mengambil sejumlah 100 μL serum dicampurkan dengan 1000 μL reagen I dan divortex selama 5 detik. Campuran didiamkan selama 5 menit selanjutnya dicampur dengan 250 μL reagen II dan divortex selama 5 detik dan didiamkan selama satu menit. Campuran kemudian dibaca serapannya setelah 1 menit. Aktivitas ALT dan AST dinyatakan dalam satuan UL. Aktivitas enzim yang terjadi diukur pada panjang gelombang 340 nm, pada suhu 37 °C. Pengukuran aktivitas ALT dan AST dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

F. Tata cara hasil

Data aktivitas dari ALT dan AST serum yang diperoleh, selanjutnya dianalisis dengan Kolmogorov Smirnov untuk mengetahui distribusi dan varian data tiap kelompok untuk melihat homogenitas antar kelompok sebagai syarat parametrik. Kemudian dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan nilai dari masing- masing kelompok. Uji Scheffe selanjutnya dilakukan untuk melihat kebermaknaan perbedaan data antara masing-masing kelompok. Perbedaan dikatakan bermakna signifikan bila memiliki nilai p0,05, sedangkan tidak bermakna tidak signifikan bila p0,05. Bila data aktivitas ALT dan AST yang diperoleh tidak normal, maka digunakan uji Kruskall-Wallis. Selanjutnya dilakukan uji Mann-Whitney untuk melihat kebermaknaan perbedaan data antar kelompok. Perbedaan dikatakan bermakna signifikan bila memiliki nilai p0,05, sedangkan tidak bermakna tidak signifikan bila p0,05. Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus sebagai berikut: Keterangan: CCl 4 = Karbon Tetraklorida 33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan adanya efek hepatoprotektif dengan adanya persen efek hepatoprotektif dari infusa daun Sonchus arvensis L. terhadap tikus jantan galur Wistar terinduksi karbon tetraklorida CCl 4 . Untuk mengetahui seberapa besar efek hepatoprotektif yang dihasilkan maka dilakukan pengujian dengan aktivitas ALT dan AST sebagai tolak ukur kuantitatif dalam penelitian ini.

A. Penyiapan Bahan

1. Determinasi tanaman Sonchus arvensis L.

Determinasi tanaman Sonchus arvensis L. yang didapat dari Wonosari, Daerah Istimewa Yogyakarta untuk menjamin kebenaran tanaman yang diteliti. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Determinasi tanaman Sonchus arvensis L. menggunakan buku acuan karangan Van Steenis 1981 hingga tingkat spesies. Bagian tanaman yang dideterminasi antara lain batang, daun, biji, dan bunga. Hasil determinasi lampiran 5 membuktikan bahwa tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah benar tanaman Sonchus arvensis L.

2. Penetapan konsentrasi infusa

Pada pembuatan infusa dilakukan penetapan konsentrasi maksimal yang dapat dibuat untuk menentukan dosis maksimal infusa daun Sonchus arvensis L. Konsentrasi maksimal adalah konsentrasi dimana semua serbuk