Gambar 17. Kromatogram TC dengan fase gerak metanol : buffer McIlvaine
Gambar 18. Kromatogram TC dengan fase gerak asetonitril : buffer McIlvaine
G. Validasi Metode HPLC
Validasi metode penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan untuk menjamin metode HPLC dalam menetapkan kadar TC. Validasi yang dilakukan
meliputi linearitas, akurasi, presisi, sensitivitas LOQ dan selektivitas resolusi. Pada penetapan kadar TC dalam daging ini dilakukan juga perbandingan kurva
baku solven dan kurva adisi. Persamaan regresi linear yang didapat yaitu pada tabel VII. Nilai slope pada kedua kurva tabel VII memiliki selisih yang besar
sehingga matriks sampel dapat mempengaruhi penetapan kadar TC.
Tabel VII. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi Kurva
R
2
Slope Persamaan regresi linear
Baku solven 0,9919
209507 y = 209507x
– 46814 Adisi
0,9976 90169
y = 90169x + 8799
TCH TC
Gambar 19. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi TC
Pada gambar 19, terlihat bahwa kurva baku solven memiliki respon yang lebih tinggi daripada kurva adisi terhadap deteksi HPLC. Dalam penelitian ini,
efek matriks yang terjadi adalah menurunkan kadar TC sehingga digunakan kurva adisi untuk melakukan penetapan kadar TC dalam daginng, agar dapat
merepresentasikan kondisi yang sebenarnya. Linearitas pada kurva baku solven dinyatakan dengan nilai R
2
sebesar 0,9919 dengan persamaan regresi linear y = 209507x-46814 sedangkan pada
kurva adisi didapatkan nilai R
2
sebesar 0,9976 dengan persamaan regresi linear y = 90169x+8799. Sensitivitas pada metode dilakukan dengan menyatakan nilai
LOQ pada kurva adisi yaitu sebesar 1 ppm. LOQ metode HPLC menggunakan kurva adisi yang didapat sebesar 0,53 ppm sehingga konsentrasi 0,2 ppm pada
kurva adisi tidak masuk dalam LOQ. Akurasi dinyatakan dengan persen difference D yang didapatkan dari
kurva adisi dapat dilihat pada tabel. Ketentuan dari FDA, menyatakan metode yang akurat memiliki nilai D dan RSD kurang dari 20. Akurasi pada kurva
adisi yang digunakan pada tabel VIII, menyatakan D lebih dari 20 pada konsentrasi 0,2 dan 1 ppm. Hasil menunjukkan akurasi yang tidak sesuai kriteria.
-500000 500000
1000000 1500000
2000000 2500000
3000000
5 10
15
A U
C
Konsentrasi ppm
Kurva adisi Kurva baku
solven Linear Kurva
adisi Linear Kurva
baku solven
Tabel VIII. D kurva adisi Konsentrasi ppm
D 0,2
134,7459 1
30,2421 3
0,7057 7
0,3219 10
0,3422
Penetapan presisi dilakukan pada kurva adisi terhadap 4 titik mulai dari 1-10 ppm dan didapatkan RSD 20 yaitu 17,2625 sehingga presisi masih
masuk kriteria pada konsentrasi 1-10 ppm. Karena keterbatasan waktu pada penetapan kadar TC dalam daging lobster ini, maka tetap digunakan persamaan
regresi linear dari konsentrasi 0,2-10 ppm karena AUC sampel yang tidak masuk interval kurva adisi bila digunakan kurva adisi dari 1-10 ppm maka hasil
penelitian ini hanya dapat dinyatakan secara kualitatif. Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode dalam memisahkan
analit secara tepat dan spesifik, parameter yang diamati adalah resolusi. Menurut Snyder et al. 2010, suatu metode analisis dikatakan selektif apabila memiliki
resolusi ≥ 1,5. Nilai ini menunjukan pemisahan antara puncak kromatogram sudah terjadi secara sempurna.
Tabel IX. Hasil perhitungan resolusi sampel TC
Sampel Waktu retensi
Resolusi Rata-rata nilai resolusi
1 5,8
0,191 2,213
10,1 2,223
2 5,8
2,223 10,1
3,656 3,208
3 5,8
2,203 10,1
3,744
Tabel X menunjukan rata-rata resolusi dari puncak TC dengan puncak lain yang terdekat adalah ≥ 1,5, yaitu 2,213 pada waktu retensi 5,8 dan 3,208
pada 10,1. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memiliki kriteria selektivitas terpenuhi karena dapat memisahkan senyawa analit dari
senyawa-senyawa lain yang ada pada matriks.
H. Penetapan Kadar Tetrasiklin TC Dalam Daging Lobster
