Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif

Gambar 4. Perubahan struktur protein akibat denaturasi Campbellet al., 2002

D. Validasi Metode Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif

Menurut Harmita 2006, validasi merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu dalam prosedur penetapan, yang digunakan untuk membuktikan bahwa parameter yang dipilih sudah memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Suatu validasi terhadap metode dapat dilakukan dengan melihat aspek akurasi, presisi, linearitas dan sensitivitas yang menunjukkan suatu metode menghasilkan parameter atau data yang valid dan dapat dipertanggung jawabkan. Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampakini divalidasi terkait linearitas yaitu dengan pembuatan kurva baku dan persamaan regresi linear. Linearitas menunjukkan respon atau parameter yang didapat sudah sesuai jika nilai koefisien korelasi r mendekati angka satu. Pada metode penetapan kadar protein ini didapatkan persamaan regresi y = 0,0589x + 0,1018 dan R² = 0,9709. Pada penelitian ini dilakukan juga pembuatan kurva adisi untuk melihat pengaruh matriks dalam sedimen terhadap penetapan kadar protein dalam sedimen. Kurva adisi yang dibuat terdiri dari 6 titik yaitu mulai dari adisi 0, 10, 30, 50, 70, dan 90 mg BSA. Kurva adisi yang didapat memiliki persamaan regresi linear y = 0,5813x + 0,054 dan R² = 0,9907. Ada tidaknya efek matriks dalam sedimen dapat diketahui dengan membandingkan kurva baku solven dengan kurva adisi pada gambar 5. Kurva adisi memberikan respon yang meningkat lebih tinggi daripada respon pada kurva baku solven. Hal ini menunjukkan adanya intervensi dari matriks sedimen pada penetapan kadar protein sehingga untuk menentukan kadar protein dalam sedimen ini digunakan persamaan regresi linear kurva adisi supaya merepresentasikan kondisi yang sebenarnya. Gambar 5. Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi protein Akurasi penetapan kadar protein dinyatakan dalam D yaitu persen difference. D pada penetapan kadar protein ini didapatkan dari perbandingan selisih konsentrasi diketahui dan konsentasi terhitung, dengan konsentrasi diketahui dari kurva adisi. Berdasarkan FDA 2013, kriteria D adalah 20. Pada tabel VI, menunjukkan hasil D kurang dari 20 mulai dari adisi 30 mg sedangkan adisi 10 mg tidak memenuhi kriteria akurasi sehingga dieksklusi dan persamaan regresi linear yang digunakan mulai dari titik adisi 30 mg dengan konsentrasi 0,16 mgml hingga adisi 90 mg dengan konsentrasi 0,48 mgml. y = 0.055x + 0.1122 R² = 0.9826 y = 0.5813x + 0.054 R² = 0.9907 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 1 2 3 4 Tin g g i d er iv a t c m Konsentrasi mgml Perbandingan kurva baku solven dan kurva adisi Kurva baku solven Kurva adisi Linear Kurva baku solven Linear Kurva adisi Tabel VI. D kurva adisi protein Adisi mg Konsentrasi mgml D 10 0,05 67,9161 30 0,16 18,8720 50 0,27 13,5893 70 0,37 4,8465 90 0,48 2,5106 Presisi penetapan kadar protein ini dinyatakan dalam RSD dari kurva adisi. Berdasarkan FDA 2013, suatu metode dikatakan memiliki keterulangan atau presisi yang baik jika nilai RSD 20. Pada penetapan kadar protein dalam sedimen dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif ini menunjukkan RSD sebesar 12,554 sehingga kriteria terpenuhi. Sensitivitas metode merupakan tingkat kepekaan suatu metode dalam mendeteksi senyawa tertentu pada konsentrasi terkecil. Sensitivitas dinyatakan dengan nilai LOQ. LOQ persamaan kurva adisi ini sebesar 0,0922 mgml.

E. Analisis Sampel