metode Lowry. Prinsip dari CBB ini mengadakan interaksi dengan struktur protein. Bentuk muatan positif dari CBB ini akan terjadi lebih banyak dalam
kondisi asam dan dapat dideteksi pada panjang gelombang maksimal 470 nm. Sebaliknya, dalam kondisi netral, CBB akan dominan dalam bentuk anion
bermuatan negatif dan akan mengadakan interaksi dengan struktur protein sehingga dapat dideteksi Kruger, 1994.
Gambar 3. Interaksi protein primer dan CBB Georgiou et al., 2008
CBB mengandung gugus sulfonat yang akan bereaksi dengan rantai samping struktur protein yaitu arginine, lysine, dan histidine. Interaksi yang
terjadi mengakibatkan warna dari CBB tereduksi memudar. Ikatan yang terjadi antara protein dengan dye adalah ikatan ionik, elektrostatik, dan van der Waals.
Ikatan van der Waals merupakan ikatan yang paling dominan terjadi dalam pewarnaan Otlets, 2005.
G. Spektrofotometri Sinar Tampak Derivatif
Spektrofotometri sinar tampak merupakan metode pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar tampak visible yang diabsorbsi oleh suatu zat.
Sinar tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi pada rentang panjang gelombang
400-800 nm dan dideteksi dalam bentuk absorbansi Dachriyanus, 2004.
Metode spektrofotometri derivatif atau metode kurva turunan adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk analisis multikomponen secara
langsung tanpa harus melakukan pemisahan terlebih dahulu walaupun dengan panjang gelombang yang berdekatan. Keuntungan dari metode spektrofotometri
derivatif adalah spektrum derivatif yang memungkinkan menganalisis multikomponen dalam campuran yang spektranya saling tumpang tindih.
Spektrum derivatif memberikan gambaran struktur yang terinci dari spektrum serapan dan gambaran ini makin jelas dari spektra derivatif pertama ke derivatif
keempat sehingga dapat dilakukan analisis kuantitatif suatu komponen dalam campuran dengan bahan yang panjang gelombangnya saling berdekatan
Nurhidayati, 2007.
H. High Performance Liquid Chromatography HPLC
High Performance Liquid Chromatography HPLC merupakan suatu metode analisis kuantitatif dengan cara memisahkan dan menganalisis analit dari
komponen lain dalam matriks sampel dengan bantuan kolom sebagai fase diam dan liquid sebagai fase gerak Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010.
Sistem HPLC dimulai dari sampel dimasukan ke dalam tempat injeksi yang menuju ke kolom kromatografi. Fase gerak menuju kolom dengan bantuan
pompa, zat-zat terlarut akan terpisah karena adanya interaksi yang bebeda antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam di dalam kolom. Zat-
zat terlarut yang sudah terpisah akan meninggalkan kolom dan terdeteksi oleh detektor. Hasil yang diperoleh dari proses tersebut adalah kromatogram yang
terdiri dari signal detektor dan waktu. Fase gerak biasanya terdiri dari beberapa campuran pelarut sehingga memiliki daya elusi dan resolusi yang diinginkan.
Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam dan sifat komponen-komponen sampel Snyder et al., 2010.
Fase gerak yang digunakan pada HPLC fase terbalik HPLC-RP adalah fase gerak yang bersifat polar, contohnya campuran larutan buffer dengan metanol
atau campuran air dengan asetonitril atau campuran metanol dengan asetonitril Gandjar dan Rohman, 2007.
Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan fase gerak, yaitu polaritas, kelarutan analit, stabilitas, pH dan kompatibilitas antar pelarut. Selain
itu, fase gerak dapat tercampur dengan baik dan tidak terdapat endapan apabila terdiri dari campuran beberapa pelarut Kazakevich dan Lobrutto, 2007.
Kolom merupakan bagian yang sangat penting dalam pemisahan komponen-komponen sampel yang terdapat di dalamnya. Oktadesilsilan C18
dan oktil silica C8 merupakan fase diam yag paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang maupun tinggi
Gandjar dan Rohman, 2007.
I. Validasi Metode Analisis
Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya Harmita, 2006. Validasi
metode analisis merupakan prosedur yang digunakan untuk menunjukan bahwa
metode analisis yang digunakan untuk kuantifikasi analit dalam matriks bersifat reliable dan reprodusibel untuk mencapai tujuannya Chan, Lam, Lee, dan Zhang,
2004.
1. Akurasi
Akurasi adalah suatu prosedur analisis untuk melihat kedekatan antara nilai terukur atau nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran dengan nilai
sebenarnya Ermer dan Miller, 2005. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali yang ditentukan dengan melakukan spiking ataupun dengan
cara metode penambahan baku standard addition method Gandjar dan Rohman, 2007. Dalam bioanalisis, nilai akurasi dapat dinyatakan dalam Difference
D yaitu perbandingan antara selisih nilai konsentrasi awal dan terukur dengan nilai konsentrasi awal. Kriteria terpenuhi jika D dibawah 20 Anonim, 2013.
2. Presisi
Presisi adalah prosedur analisis untuk melihat derajat kesesuaian hasil uji individual dari beberapa penginjeksian suatu seri baku. Presisi diukur sebagai
persen Relative Standard Deviation RSD Gandjar dan Rohman, 2007. Nilai RSD yang diperbolehkan adalah kurang dari 20 Anonim, 2013.
3. Linieritas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil- hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan Gandjar dan Rohman, 2007. Suatu metode dikatakan memiliki
linieritas yang baik jika nilai koefisien korelasri r 0,99 atau r
2
0,997 Chan et al., 2004. Pada sumber lain mengatakan bahwa nilai koefisien korelasi r
2
yang baik adalah lebih tinggi dari 0,995 Anonim, 2013.
4. Selektivitas
Selektivitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur dan membedakan dengan akurat respon analit dengan seluruh komponen sampel
yag mungkin ada dalam matriks sampel Chan et a.l, 2004.
5. Kriteria validasi
Kriteria validasi untuk bioanalisis meliputi akurasi, presisi, LOQ, dan linearitas serta pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi Anonim, 2013.
J. Landasan Teori
Lobster air tawar merupakan golongan Crustaceae yang hidup di air tawar dan kemampuannya untuk bertahan hidup lebih besar daripada udang air
payau maupun air laut. Ketersediaan protein dan kondisi habitat lobster sangat mempengaruhi pertumbuhan lobster. Salah satu masalah dalam budidaya lobster
adalah penurunan produktivitas lobster karena penyakit oleh mikroba patogen seperti Vibrio spp. Penggunaan antibiotik dalam pakan lobster dilakukan untuk
mencegah perkembangan mikroba patogen yang menyebabkan penyakit sehingga kelangsungan hidup lobster lebih panjang tetapi terjadi kasus akumulasi antibiotik
dalam tubuh lobster seperti kloramfenikol.
Selain mikroba patogen, yang tumbuh dalam media air adalah mikroba normal air. Keberadaan mikroba normal air berkontribusi baik dalam penanganan
limbah atau penumpukkan bahan organik dalam air sehingga kualitas air terjaga. Tetrasiklin merupakan senyawa antimikroba dengan spektrum luas, yaitu dapat
menghambat pertumbuhan beragam jenis mikroba yang ada di alam, baik mikroba patogen maupun mikroba normal air.Jumlah mikroba normal maupun patogen
ditentukan dengan melihat populasi mikroba dalam air. Mikroba dapat merombak bahan organik seperti protein menjadi senyawa
lebih sederhana. Penambahan populasi mikroba akan menanggulangi bahan organik yang ada di habitat lobster sehingga kualitas air terjaga. Analisis
kandungan protein dilakukan dengan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif. Metode CBB ini menggunakan reagen coomassie brilliant blue
dengan mekanisme pembentukkan warna terhadap protein primer. Protein akan berinteraksi dengan reagen sehingga larutan protein menjadi berwarna, hal ini
menunjukkan banyaknya ikatan peptida yang terjadi. Metode spektrofotometri sinar tampak ini digunakan untuk melihat absorbansi kompleks protein berwarna
dengan interval panjang gelombang cahaya visible 400-800 nm. Adanya kandungan antibiotik seperti tetrasiklin dalam akuakultur dapat
menyebabkan akumulasi dalam tubuh lobster. Untuk melihat pengaruh tersebut dilakukan analisis jumlah tetrasiklin dalam daging lobster dengan menggunakan
High Performance Liquid Chromatography HPLC. Validasi yang dilakukan meliputi pembandingan kurva baku solven dan kurva adisi, linearitas, akurasi dan
presisi serta sensitivitas. Mengetahui pengaruh pakan berantibiotik padajumlah populasi mikroba air,kadar protein sedimen, laju pertumbuhan lobster, dan adanya
kadar akumulasi tetrasiklin dalam daging dilakukan perbandingan antara perlakuan dan kontrol yang diplotkan dalam grafik versus hari perlakuan.
K. Hipotesis
