Jenis dan Rancangan Penelitian Alat Penelitian Rancangan Penelitian

22

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian berjudul “Pengaruh Pemberian Pakan Berantibiotik Pada Populasi Mikroba Air, Kadar Protein Sedimen dan Akumulasi Tetrasiklin Dengan Menggunakan Pengembangan Metode Analisis Tetrasiklin Serta Pengaruhnya Pada Laju Pertumbuhan Lobster Air Tawar Cherax Quadricarinatus ” merupakan penelitian eksperimental murni dengan membandingkan kurva hubungan lama perlakuan dengan respon antara kelompok kontrol dan perlakuan untuk melihat pengaruh yang disebabkan oleh tetrasiklin dalam pakan terhadap kualitas habitat dan laju pertumbuhan lobster air tawar.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel utama 1 Variabel bebas : lama pemberian pakan berantibiotik 2 Variabel tergantung : jumlah populasi mikroba dalam air, jumlah protein dalam sedimen, panjang lobster, berat lobster dan jumlah TCH dalam daging lobster b. Variabel pengacau 1 Variabel terkendali : volume air, cahaya matahari, kandungan klor, kesadahan air, pH air dan oksigen terlarut dalam air. 2 Variabel tidak terkendali : lobster mati.

2. Definisi Operasional

a. Pakan berantibiotik merupakan pakan lobster yang telah dimodifikasi dengan menambahkan tetrasiklin HCl ke dalam sediaan pakan. b. Lobster air tawarcrayfish Cherax quadricarinatus merupakan hewan golongan Crustaceae yang hidup di perairan tawar dan dalam penelitian digunakan sebagai hewan uji dengan kriteria yang ditentukan. c. Rumah lobster merupakan pipa yang disusun dan diikat berjajar dan digunakan sebagai tempat perlindungan untuk lobster, dibuat dari pipa dengan panjang 6 cm dan diameter 2,5 cm sebanyak 8 pipa.. d. Aerasi merupakan sistem sirkulasi udara dari luar ke dalam air dengan bantuan alat pompa elektrik dan selang. e. Budidaya permodelan merupakan metode budidaya lobster dengan merekayasa pembiakan yaitu memberikan sedimen dan rumah lobster serta aerasi yang cukup sebagai tempat hidup lobster. f. Sedimen merupakan suatu masa padat yang berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi dari lobster air tawar crayfish yang mengendap di dasar akuarium. g. Kelompok kontrol merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan pakan tanpa antibiotik. h. Kelompok perlakuan merupakan populasi lobster yang diberi perlakuan pakan berantibiotik. i. Panjang dan berat lobster merupakan parameter yang diukur pertumbuhan lobster, diukur dari kepala hingga ekor panjang. j. Populasi mikroba merupakan jumlah koloni mikroba yang ditentukan dalam satuan cfucm 2 . C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sedimen lobster air tawar, pakan lobster merek Bintang ® , standar tetrasiklinHCl kualitas p.a, China, antibiotik tetrasiklin HCl merek Tetrasanbe ® , lobster air tawar jenis crayfish Cherax quadricarinatus, air sumur dengan kriteria kesadahan 53 ppm, oksigen terlarut 7-8 ppm, suhu 25,5°C, pH 6, reagen coomasie brilliant blue R-250 kualitas p.a, Germany, phosphate buffer saline PBS pH 7 NaCl, KCl, Na 2 HPO 4 , dan K 2 HPO 4 , metanol grade HPLC, etanol kualitas p.a, akuabides, NaOH kualitas p.a, HCl kualitas p.a, standar bouvine serum albumine kualitas p.a, Germany, daging lobster air tawar jenis crayfish, buffer McIlvainepH 4 7,71 ml larutan Na 2 HPO 4 0,2 N dalam 12,29 ml asam sitrat0,1 N, asetonitril grade HPLC.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium panjang 60 cm, lebar 30 cm dan tinggi 50 cm, kincir air atau aerator merek Amara ® , fan, DO meter pengukur dissolve oxygen, rumah lobster pipa bertingkat, spuit, alat-alat gelas Pyrex, Germany, mistar merek Ziegel ® , timbangan analitik merek OHAUS ® e=1 mg, batang pengaduk, pipet tetes, pipet volume, micropipette, macropipette, flakon, pompa vacuum, corong Buchner, labu hisap, pH stick universal, cawan porselen, stamper, mortir, kertas saring, oven, vortex, centrifuge, milipore, degasser, spectrophotometer Visible SHIMADZU UV-1800, rotary evaporator, High Performance Liquid Chromatography merek SHIMADZU kolom C18.

E. Tata Cara Penelitian

1. Tahap preparasi lobster dan habitat

a. Persiapan alat dan bahan Sebanyak 12 buah akuarium 60 x 30 x 50 cm disiapkan dalam tempat terhindar dari cahaya. Lobster air tawar spesies Cherax quadricarinatus didapatkan dari peternak lobster Godean Yogyakarta dengan kriteria usia 3 bulan, panjang 5-5,5 cm dan berat 3-3,5 gram. Sedimen didapatkan dari peternak lobster air tawar Godean Yogyakarta. b. Determinasi lobster Lobster air tawar yang digunakan sebagai hewan uji dideterminasi oleh Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan menggunakan sumber determinasi berjudul Cherax quadricarinatus oleh Jones dan Wingfield, The Freshwater and Land Crayfishes of Australia oleh Clark dan The Australian Freshwater Crayfish Crustaceae:Decapoda:Parasticidae with Descriptions of New Species oleh Riek. c. Preparasi habitat lobster Sedimen yang terkumpul dihomogenkan dan ditimbang sebanyak 100 gram, lalu dimasukkan dalam akuarium dan diisi air sumur setinggi 10 cm dari dasar akuariumsetara 14 liter. Rumah lobster dan aerator dimasukkan dalam akuarium 1 rumah dan aeratorakuarium. Lobster air tawar dimasukkan dalam akuarium 15 ekorakuarium. Media ini selanjutnya digunakan untuk pemeliharaan lobster.

2. Tahap preparasi pakan lobster

a. Penetapan kadar tetrasiklin HCl TCH dalam kapsul Tetrasanbe® 1 Pembuatan stok standar TCH 1 mgml Sebanyak 100 mg standar TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml ditambahkan akuabides hingga batas tanda. 2 Validasi metode Pembuatan seri baku TCH 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; dan 0,5 mgml.. Larutan stok standar TCH 1 mgml dibuat seri, diambil 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,0 ml dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. Lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel dan dibuat persamaan regresi linear dan nilai r linearitas. Selain itu dilakukan penetapan akurasi dengan melihat D, sensitivitas LOD dan LOQ, serta presisi didapat dari sampel yang direplikasi 3 kali lalu dicari RSD. 3 Preparasi sampel kapsul Sebanyak 10 kapsul TCH 500 mg dibuka dan dikeluarkan serbuknya, ditimbang kemudian digerus dan dihomogenkan dalam mortir. Sebanyak 25 mg sampel TCH ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 100 ml dan ditambahkan akuabides hingga batas tanda. 4 Penetapan kadar TCH dengan spektrofotometri uv Blanko dibuat dari seluruh pelarut yang digunakan tanpa zat analit. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometri uv. Sampel dideteksi absorbansi dengan spektrofotometri uv pada spektrum 200-400 nm, dilakukan replikasi 3 kali pada sampel. b. Optimasi dosis TCH Sebanyak 4 akuarium kosong A, B, C, D disiapkan. Sedimen sebagai habitat awal lobster ditimbang masing-masing sebanyak 100 gram. Sedimen dimasukkan dalam akuarium dan diberi air yang telah disesuaikan dengan luas akuarium setinggi 10 cm dari dasar akuarium setara dengan 14 liter, kemudian diaduk hingga homogen. Kincir air aerator dimasukkan ke dalam akuarium dan diaktifkan. TCH sebanyak 2,25 gram; 4,5 gram; dan 9 gram dimasukkan ke dalam akuarium B, C, dan D secara berurutan, ditunggu selama 1 hari. Setelah 1 hari dilakukan sampling pada pukul 06.00 WIB dan dilakukan pengecekan jumlah populasi mikroba oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan metode perhitungan jumlah mikroba cfu. c. Pembuatan dan pola pemberian pakan berantibiotik 1 Pembuatan pakan berantibiotik Berdasarkan prosentase pakan lengkap dengan berat udang 3-15 gram maka diberikan adalah 8-4. Sesuai dengan berat lobster, digunakan prosentase sebesar 4 sehingga jumlah pakan lobster diberikan sebanyak 1,8 gramhari. Selanjutnya jumlah pakan ini digunakan untuk membuat dosis pakan selama 5 hari. Sebanyak 0,2025 gram TCH ditimbang dan dilarutkan dalam akuabides sebanyak 25 ml dalam labu takar. Sebanyak 45 gram pakan lobster dilakukan penyemprotan dengan larutan TCH secara merata. Setelah penyemprotan, pelet pakan lobster dikering udarakan hingga kering ± 3jam dengan menggunakan fan, dihindarkan dari cahaya. 2 Frekuensi pemberian pakan Pakan mengandung tetrasiklin diberikan pada lobster 3 kali sehari yaitu pada pagi hari 0,45 gram 25, sore hari 0,45 gram 25 dan malam hari 0,9 gram 50.

3. Tahap persiapankelompok kontrol dan kelompok perlakuan

a. Pembuatan kelompok kontrol Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko 0 hari dan 5 akuarium perlakuan pemberian pakan biasa tanpa tetrasiklin dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25 pada pagi dan sore serta 50 pada malam hari. b. Pembuatan kelompok perlakuan Perlakuan pada 6 akuarium yaitu 1 akuarium sebagai blangko 0 hari dan 5 perlakuan pemberian pakan berantibiotik dengan lama pemberian 3 hari, 5 hari, 7 hari, 14 hari dan 28 hari. Pemberian pakan berantibiotik dilakukan 3 kali dalam sehari dengan jumlah pakan 25 pada pagi dan sore serta 50 pada malam hari.

4. Tahap preparasi analit

a. Ekstraksi protein dalam sedimen Proses ekstraksi pada penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Mayer, Schick, dan Setchell 1986. Sedimen kering ditimbang sebanyak 0,2 gram dan dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml. Campuran dalam flakon ditutup, divortex lalu ditunggu selama 2 jam OT pada suhu 60 o C di dalam oven. Setelah OT, campuran disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml dan pH dinetralkan dengan HCl 2,5 N hingga pH 7-8, lalu dimasukkan dalam labu takar 5 ml, ditambahkan PBS hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dideteksi absorbansinya dengan menggunakan metode CBB dan spektrofotometer sinar tampak derivatif. b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster 1 Preparasi sampel ekstrak daging Lobster pada perlakuan hari ke 14 13,12 gram dan 28 9,02 gram diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang. Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari. 2 Ekstraksi tetrasiklin Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml buffer McIlvaine; 1 ml NaOH pH 4 kemudian divortex dan dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi untuk deteksi dengan metode HPLC.

5. Tahap persiapan metode penetapan kadar

a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini. b. Metode penetapan kadar tetrasiklin 1 Orientasi panjang gelombang tetrasiklin Standar tetrasiklin HCl TCH ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam HCl : akuabides 1:1 ditambahkan hingga tanda batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm. 2 Penentuan puncak tetrasiklin a Pembuatan larutan blangko Larutan HCl : akuabides 1:1 disiapkan sebanyak 5 ml, diambil 0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan sampel. b Pembuatan larutan standar TCH Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. c Pembuatan larutan standarTC Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. 3 Optimasi fase gerak HPLC a Kondisi HPLC 1 Fase diam : kolom C18 oktadesil silika 2 Detektor : uv-sinar tampak 3 Fase gerak : a Asetonitril : buffer McIlvaine pH 4 50:50 b Metahol : buffer McIlvaine pH 4; asam sitrat dan natrium bifosfat 50:50 4 Panjang gelombang : 270 nm hasil orientasi 5 Flow rate : 0,5 mlmenit b Pembuatan fase gerak 1 Pembuatan metanol : buffer McIlvaine pH 4 Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50 vv. Metanol dan buffer McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. 2 Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine pH 4 Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50 vv. Asetonitril dan buffer McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. c Persiapan instrumen HPLC Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol HPLC grade selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan waktu elusi 13 menit. 6. Tahap validasi metode penetapan kadar a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif 1 Linearitas a Pembuatan stok albumin BSA 40 mgml Sebanyak 2 gram albumin BSA dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas. b Pembuatan seri baku albumin BSA Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mgml. c Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400- 800 nm. d Pembuatan kurva baku solven Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi liniernya. 2 Pembuatan kurva adisi Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E, F ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan 90 mg dalam flakon B, C, D, E, F secara berurutan. Kemudian dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan spektrofotometri sinar tampak derivatif. 3 Akurasi Akurasi dinyatakan dalam bentuk D dari kurva adisi. Nilai D yang baik adalah kurang dari 20 4 Presisi Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung RSD. Nilai RSD yang baik adalah kurang dari 20 5 Limit Of Quantification LOQ LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SDslope b. Validasi metode HPLC 1 Linearitas a Pembuatan stok tetrasiklinHCl TCH 500 ppm Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan HCl : akuabides 1:1 hingga tanda batas. b Pembuatan seri TC Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120 ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200 µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas. c Analisis dengan HPLC Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi. d Pembuatan kurva baku solven Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. 2 Pembuatan kurva adisi a Pembuatan seri TC Daging lobster bebas tetrasiklin dihaluskan dengan menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing- masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E. Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides 1:1 ditambahkan sebanyak 4980 A, 4900 B, 4700C, 4300D, 4000E µl dengan micropipette ke dalam flakon. b Analisis tetrasiklindengan HPLC Masing-masing seri baku A,B,C,D,E dalam flakon divortex selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke HPLC. c Pembuatan kurva adisi Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven. 3 Akurasi Akurasi didapatkan dari perhitungan D kurva adisi. 4 Presisi Presisi didapat dari perhitungan RSD 3 replikasi kurva adisi. 5 Selektivitas Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva adisi. 6 Limit Of Quantification LOQ LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SDslope

7. Analisis sampel

a. Analisis kuantitatif jumlah populasi mikroba pada sampel air 1 Preparasi sampel air kelompok kontrol dan kelompok perlakuan a Sampling air dilakuakan pada pukul 06.00 WIB. Air dalam akuarium diaduk hingga homogen dan ditunggu selama 5 menit hingga partikel sedimen mengendap kemudian dilakukan pengambilan air, 2 cm diatas sedimen secara random dengan spuit yang telah dimodifikasi 100 ml, dimasukkan dalam botol steril yang disediakan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. b Penetapan jumlah populasi mikroba dilakukan oleh Bagian Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta dengan menggunakan metode perhitungan jumlah mikroba cfu dengan colony counter. b. Analisis kuantitatif protein pada sampel sedimen 1 Preparasi NaOH 0,1 N dan HCl 2,5 N NaOH kualitas p.a ditimbang sebanyak 0,4 gram, ditambahkan akuabides dalam labu takar 100 ml hingga batas tanda. HCl kualitas p.a diambil 2,083 ml diencerkan dengan akuabides dalam labu takar 10 ml hingga batas tanda. 2 Preparasi phosphate buffer salinePBS Sebanyak 4 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,72 gram Na 2 HPO 4 , dan 0,12 gram KH 2 PO 4 ditimbang dan dimasukkan dalam labu takar 500 ml, ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 3 Preparasi reagen coomasie brilliant blue Sebanyak 10 mg CBB ditimbang dan dilarutkan dalam 20 ml PBS dan 10 ml etanol, disebut campuran A. Sebanyak 3 ml campuran A dimasukkan dalam labu takar 100 ml. Ditambahkan 8 ml PBS dan 3,75 ml etanol kemudian ditambahkan akuabides hingga tanda batas. 4 Preparasi protein dalam sedimen Air akuarium didekantir dan sedimen diambil seluruhnya, dimasukkan dalam botol sampel. Sedimen disaring menggunakan corong Buchner dan pompa vacuum hingga kering. Sedimen kering dimasukkan dalam mortir dan digerus dengan stamper hingga homogen. Sedimen ditimbang sebanyak 0,2 gram dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan NaOH 0,1 N sebanyak 6 ml dengan menggunakan makropipet. Campuran diaduk dan divortex hingga homogen lalu dimasukkan dalam oven dengan suhu 60 C, ditunggu selama 2 jam. Setelah 2 jam, dikeluarkan dari oven dan disentrifuge dengan kecepatan putar 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 4 ml ditambahkan HCl 2,5 N hingga pH 7-8 kemudian dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan PBS hingga tanda batas. 5 Analisis kuantitatif protein Blanko dibuat dari seluruh pelarut dan reagen yang digunakan tanpa ada sampel. Blanko dimasukkan dalam kuvet, dilakukan baseline terhadap spektrofotometer sinar tampak. Sampel dalam labu takar diambil sebanyak 1 ml dimasukkan dalam labu takar 5 ml. Reagen CBB ditambahkan dalam labu takar hingga tanda batas dan dilakukan operating time hingga 15 menit. Setelah 15 menit, campuran dimasukkan dalam kuvet dan dicek absorbansi dengan spektrofotometer sinar tampakpada spektrum 400-800 nm. Spektra yang keluar diderivatisasi level kedua kemudian dilakukan pengukuran tinggi puncak derivat. c. Pengukuran panjang dan berat lobster Lobster yang ada dalam akuarium dikeluarkan seluruhnya dan ditimbang berat serta diukur panjangnya. Pengukuran berat dengan menggunakan timbangan analitik dan pengukuran panjang dengan mengukur dari ujung kepala sampai ekor. Kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan nilai slope dari kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang dan berat lobster hari ke 0. d. Analisis kuantitatif tetrasiklin dalam daging lobster Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu ditambahkan asetonitril sebanyak 1,5 ml kemudian ditambahkan 1,5 ml buffer McIlvaine pH 4. pH campuran dinaikkan dengan menggunakan NaOH 2,5 N sebanyak 1 ml lalu ditambahkan asetonitril 1,5 ml. Campuran dievaporasi dengan rotary evaporator dengan suhu 40 o C selama 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas, lalu disaring dengan milipore dan dilakukan degassing selama 5 menit lalu dimasukkan dalam vial. Sampel dideteksi dengan HPLC.

F. Analisis Hasil

1. Validasi metode spektrofotometri uv

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi r yang diperoleh dari absorbansi tetrasiklin HCl dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : D = C terhitung – C diketahui C terhitung x 100 c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : RSD = SD rata-rata x 100 d. Sensitivitas. Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung LOD dicari dengan rumus 3,3 x SDslope dan LOQ dengan 10 x SDslope.

2. Validasi metodespektrofotometri sinar tampak derivatif

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi r yang diperoleh dari tinggi derivat spektrum protein BSA dari data penentuan kurva baku dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : D = [C diketahui – C terhitung] C diketahui x 100 c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : RSD = SD rata-rata x 100 d. Sensitivitas. Sensitivitas dapat dicari dengan menghitung LOQ konsentrasi terkecil kurva adisi yang masih bisa terkuantifikasi baik.

3. Validasi metode HPLC

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dari koefisien korelasi r yang diperoleh dari data AUC penentuan kurva baku ke dalam regresi linear. b. Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus : D = [C diketahui-C terhitung] C diketahui x 100. c. Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus : RSD = SD rata-rata x 100. d. Sensitivitas. Sensitivitas dicari dengan menghitung LOQ konsentrasi terkecil pada kurva adisi yang masih dapat terkuantifikasi baik.

4. Analisis jumlah populasi mikroba air

a. Evaluasi hasil. Hasil uji jumlah populasi mikroba cfucm 2 dikelurkan oleh Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus log jumlah populasi mikroba kelompok kontrol dan log jumlah populasi mikroba kelompok perlakuan. Kurva kelompok kontrol dan perlakuan dibandingkan.

5. Analisis protein dengan metode CBB dan spektrofotometri sinar tampak

derivatif a. Hitung kadar protein. Kadar protein dihitung dengan memasukkan respon tinggi derivat dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi dalam gram sedimen. b. Evaluasi hasil. Evaluasi hasil didapat dari perbandingan kurva hari perlakuan versus selisih kadar protein kelompok kontrol dan perlakuan dan kadar protein hari ke 0. Slope dari kurva kelompok kontrol dan perlakuan dicari dan dibandingkan.

6. Penentuan panjang dan berat lobster pertumbuhan lobster

a. Panjang lobster. Data panjang lobster diolah dengan membandingkan slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok kontrol dan perlakuan dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari dan dilakukan perbandingan. No Hari Jumlah populasi mikroba Kontrol K Jumlah populasi mikroba Perlakuan P cfucm 2 cfucm 2 1 2 3 3 5 4 7 5 14 6 28 b. Berat lobster. Data berat lobster diolah dengan membandingkan slope kurva hubungan hari perlakuan dengan selisih panjang kelompok kontrol dan perlakuan dengan lobster hari ke 0 kelompok kontrol dan perlakuan. Slope kurva kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dicari dan dilakukan perbandingan.

7. Penetapan kadar tetrasiklin dalam daging

Kadar tetrasiklin dihitung dengan memasukkan respon AUC dalam persamaan regresi linear y = bx+a, lalu dikalikan faktor pengenceran sehingga didapatkan konsentrasi awal dalam daging. No Hari Panjang Lobster Kontrol K Panjang Lobster Perlakuan P Selisih Dengan Hari ke 0 Cm Cm K P 1 2 3 3 5 4 7 5 14 6 28 No Hari Berat Lobster Kontrol K Berat Lobster Perlakuan P Selisih Dengan Hari ke 0 Gram Gram K P 1 2 3 3 5 4 7 5 14 6 28

G. Rancangan Penelitian

46

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh tetrasiklin antibiotik dalam pakan terhadap perkembangan lobster air tawar dalam habitat hidup lobster dibandingkan dengan kontrol dalam jangka waktu tertentu. Ada empat parameter yang diteliti dalam penelitian ini, meliputi jumlah populasi mikroba dalam air, kandungan protein dalam sedimen, panjang dan berat lobster serta penetapan kadar tetrasiklin dalam daging lobster sebagai indikator adanya akumulasi. Penelitian ini diawali dengan persiapan habitat dan pakan serta pembagian kelompok lobster.

A. Tahap Persiapan Habitat Lobster Air Tawar

Dalam penelitian ini digunakanbudidaya permodelan yaitu dengan melakukan modifikasi terhadap model pembiakan semi intensif, meliputi pemberian sedimen dalam habitat, pemberian perlindungan rumah lobster dan tidak ada penggantian air selama perlakuan. Alat dan bahan yang dibutuhkan untuk persiapan habitat adalah sedimen, air, rumah lobster, dan aerator. Sedimen berasal dari sisa pakan maupun hasil ekskresi lobster air tawar crayfish yang mengendap sehingga habitat yang dibuat menyerupai habitat di alam. Dalam pemeliharan lobster air tawar crayfish ini diperlukan media yang layak untuk tumbuh kembangnya, seperti kesadahan, ketersediaan oksigen, derajat keasaman, suhu dan kandungan kimia dalam air. Menurut Lukito dan Prayugo 2007, lobster air tawar crayfish dapat hidup dalam air dengan kondisi kesadahan 50 mgL