b. Ekstraksi tetrasiklin dalam daging lobster
1 Preparasi sampel ekstrak daging
Lobster pada perlakuan hari ke 14 13,12 gram dan 28 9,02 gram diambil daging pada abdomen dan dibersihkan dari cangkang kulit
lobster. Daging dihaluskan menggunakan mortir dan ditimbang. Daging halus dimasukkan dalam campuran HCl dan akuabides
dengan perbandingan 1 : 1 sebanyak 40 ml. Sampel ditutup dan disimpan dalam suhu rendah dan terhindar dari cahaya matahari.
2 Ekstraksi tetrasiklin
Ekstrak daging divortex dan diambil sebanyak 5 ml lalu disentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml
dimasukkan dalam flakon dan ditambahkan 3 ml asetonitril; 1,5 ml buffer McIlvaine; 1 ml NaOH pH 4 kemudian divortex dan
dievaporasi hingga asetonitril menguap seluruhnya 2 jam. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer
McIlvaine hingga tanda batas. Sampel ini selanjutnya dipreparasi untuk deteksi dengan metode HPLC.
5. Tahap persiapan metode penetapan kadar
a. Metode penetapan kadar protein dalam sedimen
Kadar protein dalam sedimen ditetapkan dengan menggunakan metode CBB R dan spektrofotometri sinar tampak derivatif yang dikembangkan
oleh Yolanda Novia Widyawati serangkaian dengan penelitian ini.
b. Metode penetapan kadar tetrasiklin
1 Orientasi panjang gelombang tetrasiklin
Standar tetrasiklin HCl TCH ditimbang sebanyak 50 mg dan dilarutkan dalam HCl : akuabides 1:1 ditambahkan hingga tanda
batas dalam labu takar 10 ml. Larutan TCH sebanyak 0,5 ml diekstraksi. Kemudian hasil ekstraksi disaring dengan milipore dan
dilakukan degassing lalu dicek absorbansi dengan spektrofotometri uv dengan interval panjang gelombang 200-400 nm.
2 Penentuan puncak tetrasiklin
a Pembuatan larutan blangko
Larutan HCl : akuabides 1:1 disiapkan sebanyak 5 ml, diambil 0,5 ml lalu diberi perlakuan ekstraksi sama seperti perlakuan
sampel. b
Pembuatan larutan standar TCH Larutan TCH 0,2 ppm dalam asetonitril : buffer McIlvaine
disiapkan dan dideteksi dengan menggunakan HPLC. c
Pembuatan larutan standarTC Larutan standar TCH dalam HCl : akuabides disiapkan dan
diekstraksi hingga didapat konsentrasi 0,2 ppm dan dideteksi dengan menggunakan HPLC.
3 Optimasi fase gerak HPLC
a Kondisi HPLC
1 Fase diam : kolom C18 oktadesil silika
2 Detektor : uv-sinar tampak
3 Fase gerak :
a Asetonitril : buffer McIlvaine pH 4 50:50
b Metahol : buffer McIlvaine pH 4; asam sitrat dan
natrium bifosfat 50:50 4
Panjang gelombang : 270 nm hasil orientasi 5
Flow rate : 0,5 mlmenit b
Pembuatan fase gerak 1
Pembuatan metanol : buffer McIlvaine pH 4 Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi
fase gerak yaitu campuran metanol dan buffer McIlvaine dengan perbandingan 50:50 vv. Metanol dan buffer
McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut
dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing
menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. 2
Pembuatan asetonitril : buffer McIlvaine pH 4
Fase gerak dan pelarut yang digunakan adalah hasil optimasi fase gerak yaitu campuran asetonitril dan buffer McIlvaine
dengan perbandingan 50:50 vv. Asetonitril dan buffer
McIlvaine yang telah dibuat, masing-masing disaring menggunakan solvent membrane filter sesuai sifat pelarut
dengan bantuan pompa vakum. Kemudian diletakkan dalam chamber fase gerak HPLC lalu dilakukan proses degassing
menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. c
Persiapan instrumen HPLC Kolom HPLC dicuci dengan menggunakan metanol HPLC
grade selama 1 jam kemudian dilakukan conditioning dengan fase gerak selama 1 jam dan dicek baseline hingga kolom siap
digunakan. Vial berisi standar TCH 20 ppm dimasukkan dalam tray dan dicek AUC menggunakan HPLC detektor UV dengan
waktu elusi 13 menit. 6.
Tahap validasi metode penetapan kadar
a. Validasi spektrofotometri sinar tampak derivatif
1 Linearitas
a Pembuatan stok albumin BSA 40 mgml
Sebanyak 2 gram albumin BSA dimasukkan dalam labu takar 50 ml dan ditambahkan PBS hingga tanda batas.
b Pembuatan seri baku albumin BSA
Sebanyak 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, dan 1000 µl dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS
hingga tanda batas. Konsentrasi dibuat 0,80; 1,20; 1,60; 2,00; 2,40; 2,80; 3,40; 3,60; dan 4,00 mgml.
c Analisis dengan spektrofotometri sinar tampak derivatif
Sebanyak 1 ml diambil dari setiap seri baku dimasukkan dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan reagen CBB hingga tanda
batas dan ditunggu selama 15 menit. Sampel dicek spektrum dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak pada 400-
800 nm. d
Pembuatan kurva baku solven Hasil spektrum yang keluar setiap seri baku dilakukan
derivatisasi kedua. Setiap konsentrasi pada hasil spektrum derivatisasi diplotkan dan dicari nilai r dari persamaan regresi
liniernya. 2
Pembuatan kurva adisi Sedimen ditimbang masing-masing 0,2 gram dimasukkan dalam
flakon A, B, C, D, E, F ditambahkan albumin 10, 30, 50, 70, dan 90 mg dalam flakon B, C, D, E, F secara berurutan. Kemudian
dilakukan preparasi dan ekstraksi sesuai dengan sampel sedimen lalu dilakukan pengecekan tinggi derivat dengan menggunakan CBB dan
spektrofotometri sinar tampak derivatif.
3 Akurasi
Akurasi dinyatakan dalam bentuk D dari kurva adisi. Nilai D yang baik adalah kurang dari 20
4 Presisi
Presisi didapatkan dari kurva adisi yang direplikasi sebanyak 3 kali dan dihitung RSD. Nilai RSD yang baik adalah kurang dari 20
5 Limit Of Quantification LOQ
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SDslope
b. Validasi metode HPLC
1 Linearitas
a Pembuatan stok tetrasiklinHCl TCH 500 ppm
Sebanyak 5 mg TCH dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan HCl : akuabides 1:1 hingga tanda batas.
b Pembuatan seri TC
Seri konsentrasi TC dibuat 2, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, dan 120 ppm. Sebanyak 20, 120, 240, 360, 480, 600, 720, 960 dan 1200
µl dari stok TCH 500 ppm dimasukkan dalam labu takar 5 ml ditambahkan HCl : akuabides hingga tanda batas. Tiap seri baku
diambil 0,5 ml dan diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan labu takar 5 ml dan ditambahkan buffer hingga tanda batas.
c Analisis dengan HPLC
Setiap seri baku dimasukkan dalam vial HPLC. Sampel dicek dengan menggunakan HPLCdengan kondisi optimasi.
d Pembuatan kurva baku solven
Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri baku diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya
y = bx+a. 2
Pembuatan kurva adisi a
Pembuatan seri TC Daging
lobster bebas
tetrasiklin dihaluskan
dengan menggunakan mortar dan stamper. Daging ditimbang masing-
masing 1 gram dimasukkan dalam flakon A, B, C, D, E. Sebanyak 20, 100, 300, 700, 1000 µl dari stok TCH 500 ppm
dimasukkan dalam flakon B, C, D , E. HCl : akuabides 1:1 ditambahkan sebanyak 4980 A, 4900 B, 4700C, 4300D,
4000E µl dengan micropipette ke dalam flakon. b
Analisis tetrasiklindengan HPLC Masing-masing seri baku A,B,C,D,E dalam flakon divortex
selama 3 menit lalu ditambahkan NaCL 0,1 g dan dilakukan sentrifuge 3000 rpm selama 20 menit. Supernatant sampel
A,B,C,D,E diambil sebanyak 0,5 ml dimasukkan dalam flakon lalu diekstraksi. Hasil evaporasi dimasukkan dalam labu takar
5 ml ditambahkan buffer hingga batas tanda. Larutan disaring dengan milipore dan dilakukan degassing untuk diinjeksikan ke
HPLC. c
Pembuatan kurva adisi Hasil kromatogram berupa AUC pada pengecekan seri adisi
diplotkan dan dicari nilai r serta persamaan regresi liniernya y = bx+a. Kurva adisi dibandingkan dengan kurva baku solven.
3 Akurasi
Akurasi didapatkan dari perhitungan D kurva adisi. 4
Presisi Presisi didapat dari perhitungan RSD 3 replikasi kurva adisi.
5 Selektivitas
Selektivitas dilihat dari nilai resolusi pada pengecekan AUC kurva adisi.
6 Limit Of Quantification LOQ
LOQ didapatkan dari kurva adisi dengan menggunakan rumus : LOQ = 3,3 x SDslope
7. Analisis sampel
