Variabel Penelitian Metode Pengumpulan Data Kerangka Kerja Prosedur Penelitian

3.3 Variabel Penelitian

a. Variabel Independen : Klasifikasi berat badan : obesitas, overweight dan normal b. Variabel dependent : Kadar Estradiol, leptin dan profil lipid 3.4 Tempat dan Waktu Penelitian 3.4.1 Tempat Pengambilan sampel dilakukan di Poltekkes Aceh dan komunitas diwilayah kota Banda Aceh dan sekitarnya. Pengambilan sampel darah dilakukan di laboratorium RSU Meuraxa Kota Banda Aceh. Pemeriksaan profil lipid, kadar Estradiol dan kadar Leptin dilakukan di Laboratorium Spectrum International Medan.

3.4.2 Waktu

Penelitian ini dilakukan selama empat 4 bulan yaitu mulai bulan Juli - Oktober 2014.

3.5 Populasi dan Sampel Penelitian

3.5.1 Populasi

Populasi penelitian adalah semua wanita yang berusia 20 - 40 tahun yang berdomisili di Kota Banda Aceh dan sekitarnya.

3.5.2 Sampel

1. Penentuan Sampel Sampel dalam penelitian dibagi menjadi 3 tiga kelompok, yaitu kelompok obesitas , overweight dan berat badan normal yang memenuhi criteria sebagai berikut : Universitas Sumatera Utara a. Kriteria inklusi 1. Wanita yang obesitas, overweight dan berat badan normal 2. Menyetujui dan menandatangani informed consent 3. Berada pada hari ke 6 siklus menstruasi b. Kriteria ekslusi 1. Menderita penyakit jantung, hipertensi, ginjal, keganasan, hepatitis dan diabetes. 2. Menggunakan obat jangka panjang misal steroid,tiazolidinedione dll 3. Menggunakan kontrasepsi hormonal 4. Menggunakan terapi hormon Estrogen, Testoteron dll 5. Telah dilakukan ovariektomi 6. Memiliki kadar trigliserida 400 mgdl 2. Penentuan besar sampel Rumus Besar Sampel Za√2PQ+ Zβ√P 1 Q 1 +P 2 Q 2 2 N1=N2 = ----------------------------------- P 1 -P 2 2 N1 = N2 = Jumlah sampel Za = Derajat kepercayaan 95 = 1,64 Z β = 20 = 0,84 P 2 = kepustakaan= 0,1 Ardikani et al,2009. Q 2 = 1-P 2 =1-0,1=0,9 PІ- PЇ = Selisih proporsi yang dianggap bermakna ditetapkan 0,2 P 1 = PЇ + 0,20 = 0,1 + 0,2 = 0,3 Universitas Sumatera Utara Q1 = 1- P = 1 – 0,3 = 0,7 P = PІ + PЇ2 = 0,3 + 0,12 = 0,2 Q = 1-P = 1 – 0,2 = 0,8 = 1,64√2 0,2 0,84 + 0,84√0,3 0,7 +0,1 0,9 2 -------------------------------------------------------------- 0,3-0,1 2 = 25 Sehingga besar sampel untuk tiap kelompok adalah 25 orang. 3. Tehnik pengambilan sampel Pengambilan sampel dilakukan dengan tehnik purposive sampling yaitu pengambilan sampel berdasarkan tujuan penelitian sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi.

3.6 Metode Pengumpulan Data

Data yang dikumpulkan merupakan data primer. Meliputi pengumpulan data responden dengan menggunakan kuisioner dan pengukuran BMI serta data hasil pemeriksaan estradiol,leptin dan profil lipid TC, HDL-C, LDL-C dan trigliserida. Universitas Sumatera Utara

3.7 Kerangka Kerja

3.8 Prosedur Penelitian

a. Persiapan penelitian 1. Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan komite etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. 2. Validasi metode analisis Validasi metode analisis dilakukan sebelum pemeriksaan sampel dilakukan.Akurasi ketelitiankecermatan merupakan ukuran perbedaan atau kedekatan antara rata-rata hasil uji dengan nilai sebenarnya true value . Nilai akurasi ditentukan dari besarnya penyimpangan data hasil uji dengan nilai sesungguhnya true value. Akurasi dapat dinyatakan sebagai koefisien variasi CV dengan melakukan pengulangan uji sebanyak 5 x pada sampel yang sama dan dihitung dengan Rumus : Rumus koefisien variasi : Penentuan Katagori Subjek Penelitian: Anamnesa Pengukuran BMI, Lp, Lemak Sub cutan Obesitas Normal Pengambilan sampel darah Pemeriksaan Kadar Leptin Pemeriksaan Estradiol Pemeriksaan Profil Lipid Analisa Hasil Overweight Universitas Sumatera Utara Ket : CV : Koefisien variasi SD : standar deviasi X : rata-rata hasil pemeriksaan setiap prosedur b. Sebagai skrining awal,subjek di anamnesa tentang umur , riwayat kesehatan dan data indeks massa tubuh, lingkar pinggang dan lemak sub cutan. Subjek yang masuk kriteria inklusi kemudian melakukan prosedur informed consent yang dilakukan peneliti. Peneliti akan menjelaskan seluruh prosedur penelitian. Bila subjek bersedia ikut serta dalam penelitian, dipersilahkan menandatangani formulir persetujuan. Subjek akan mendapatkan salinan lembar persetujuan. c. Pengukuran berat badan BB dan tinggi badan TB Penimbangan berat badan dilakukan dengan timbangan digital Merk GEA. Pengaktifan alat timbang dengan cara menekan permukaan timbangan. Mula- mula akan muncul angka bervariasi dan tunggu sampai muncul angka 0,00. berarti timbangan siap digunakan 1 Responden diminta naik ke alat timbang dengan posisi kaki tepat di tengah alat timbang tetapi tidak menutupi jendela baca tanpa menggunakan alas kaki. 2 Perhatikan posisi kaki responden tepat di tengah alat timbang, sikap tenang dan kepala memandang lurus kedepan. Universitas Sumatera Utara 3 Angka di monitor alat timbang akan muncul, dan tunggu sampai angka tidak berubah Statis 4 Catat angka yang terakhir 5 Angka hasil penimbangan diambil sampai 1 angka dibelakang koma 6 Minta Responden turun dari alat timbang 7 Alat timbang akan Off secara otomatis. Pengukuran tinggi badan dilakukan dengan menggunakan alat ukur tegak microtaise dengan kapasitas 2 meter sampai ketepatan 0,1 cm. Hasil dibaca dalam cm. 1 Minta responden melepaskan alas kaki sandalsepatu, topi penutup kepala. 2 Pastikan alat geser berada diposisi atas. 3 Reponden diminta berdiri tegak, persis di bawah alat geser. 4 Posisi kepala dan bahu bagian belakang, lengan, pantat dan tumit menempel pada dinding tempat microtoise di pasang. 5 Pandangan lurus ke depan, dan tangan dalam posisi tergantung bebas. 6 Gerakan alat geser sampai menyentuh bagian atas kepala responden. Pastikan alat geser berada tepat di tengah kepala responden. Dalam keadaan ini bagian belakang alat geser harus tetap menempel pada dinding. 7 Baca angka tinggi badan pada jendela baca ke arah angka yang lebih besar ke bawah Pembacaan dilakukan tepat di depan angka skala pada garis merah, sejajar dengan mata petugas. Universitas Sumatera Utara 8 Apabila pengukur lebih rendah dari yang diukur, pengukur harus berdiri di atas bangku agar hasil pembacaannya benar. 9 Pencatatan dilakukan dengan ketelitian sampai satu angka dibelakang koma. d. Pengukuran lingkar pinggang dilakukan dengan posisi responden berdiri tegak dan diukur diantara crista illiaca dan costa XII. Katagori IDF 2006, obesitas pada wanita bila lingkar pinggang 80 cm. e. Pengukuran lemak subcutan pada area triseps dilakukan dengan posisi berdiri tegak. Pengukuran pada bagian lateral lengan dengan bahu dengan sudut 90˚ menggunakan pita pengukur. Titik tengah ditandai pada sisi samping lengan. Pengukuran diambil 1 cm diatas tanda tersebut dengan menggunakan Skinfold caliper. Obesitas pada wanita bila lemak triseps 25,1 mm Ramayulis, 2013. Pengukuran dilakukan 3 kali, dan diambil hasil rata2 dari ketiga pemeriksaan tersebut. Dan pencatatan dilakukan dengan ketelitian 1 angka dibelakang koma. Pengambilan dan pemeriksaan sampel darah : 1. Pengambilan sampel Dilakukan pada pagi hari Pkl. 08.00 – 10.00 WIB setelah subjek berpuasa selama 10-12 jam. Pengambilan sampel dilakukan dengan mengambil darah vena cubiti sebanyak 6 ml, dibagi dua dan dimasukkan kedalam 2 tabung. Tabung pertama berisi EDTA dan tabung kedua berisi clot activator. a. Pengolahan serum 1 Masukkan 3 ml darah kedalam tabung yang telah berisi clot activator 2 Diamkan 10-15 menit Universitas Sumatera Utara 3 Centrifugasi selama 8 menit dengan kecepatan 3200 rpm 4 Ambil serum yang berada dibagian atas tabung dan masukkan ketabung evendrof. 5 Simpan dalam lemari es dengan suhu - 20˚C b. Pengolahan plasma 1 Masukkan 3 ml darah kedalam tabung yang telah berisi EDTA 2 Diamkan selama 10 menit 3 Centrifugasi selam 8 menit dengan kecepatan 3200 rpm 4 Ambil plasma yang berada dibagian atas tabung dan masukan ketabung evendrof. 5 Simpan dalam lemari es dengan suhu - 20˚C Plasma pada tabung EDTA akan digunakan untuk pemeriksaan Leptin Plasma, sedangkan serum pada tabung biasa akan digunakan untuk pemeriksaan profil lipid dan kadar estradiol. Serum untuk pemeriksaan profil lipid, estradiol dan plasma untuk pemeriksaan leptin disimpan dalam suhu - 20 ˚C sampai diperiksa. 2. Pemeriksaan Profil Lipid 1 Pemeriksaan Total Cholesterol Pemeriksaan kolesterol total dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatis cholesterol oxidase peroxidasephenol4- aminophenazone metode CHOD-PAP . a Prinsip pemeriksaan Kolesterol ditentukan setelah hidrolisis dan oksidasi enzimatis. Indicator kalorimetri quinoneimine terbentuk dari 4-aminoantipyrine Universitas Sumatera Utara dan phenol dengan adanya hydrogen peroxidase dibawah pengaruh katalitik peroxidase. Reaksi kimia yang terjadi dalam pemeriksaaan adalah : b Komposisi reagensia R1 4 x 100 ml reagen enzyme Phosphase buffer pH 6,5 100 mmoll 4 aminophenazone 0,25 mmoll Phenol 5 mmoll Peroxidase 5 KUl Cholesterol esterase 150 Ul Cholesterol oxidase 100 Ul Sodium azide 0,05 23 ml standar : cholesterol 200 mgdl atau 5,17 mmoll c Persiapan reagen Reagen enzyme R1 dan standar 2 telah siap digunakan. Specimen yang digunakan untuk pemeriksaan ini adalah serum. d Prosedur 1. Larutan disiapkan dengan komposisi ; Reagent Blanko Sampel atau standar Sampelstandar R1 - 1000 µl 10 µl 1000 µl Universitas Sumatera Utara 2. Larutan yang telah dicampur dan Inkubasi selama 10 menit dalam suhu 37˚C atau 20 menit dalam suhu 20-25 ˚C. 3. Baca absorbansi sampel dan standar dengan panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit dan bandingkan dengan blangko. e Kalkulasi Cholesterol mgdL = 200 x Absorbansi sampel mgdL Absorbansi standar 2 Pemeriksaan LDL cholesterol Konsentrasi kolesterol-LDL LDL-C dihitung berdasarkan kadar kolesterol total, kolesterol HDL dan trigliserida dengan menggunakan rumus Fried dan Wald yaitu; LDL-C = TC – HDL-C – TG5 mg dl LDL-C = TC – HDL-C – TG2.2 mmol l Ket: TC ; Total Cholesterol HDL-C ; HDL Cholesterol TG ; Trigliserida 3 Pemeriksaan Kolesterol HDL Pengukuran kadar kolesterol HDL dilakukan dengan teknik presipitasi yang dilanjutkan dengan pemeriksaan cholesterol liquicolor. a Prinsip pemeriksaan Pemeriksaan kolesterol HDL diawali dengan pemisahan kolestreol HDL dengan menggunakan reagensia presipitan. Kilomikron, very low density lipoprotein VLDL dan LDL serum dipresipitasi dengan Universitas Sumatera Utara menambahkan phosphotungistic acid dan magnesium klorida MgCLЇ. Setelah sentrifugasi, supernatan yang diperoleh mengandung HDL. Kemudian diperiksa kadarnya dengan menggunakan human cholesterol liquicolor. b Persiapan reagensia Reagen presipitan 4 x 80 ml presipitan Phosphotungesic acid 0,55 mmoll Magnesium klorida 25 mmoll Standar 1 x 3 ml standar : kolesterol 50 mgdl 1,29 mmoll c Specimen yang digunakan adalah serum d Prosedur persiapan cholesterol presipitan 1. Pipet kedalam tabung sentrifugasi Makro Semi Mikro Sampel Presipitan a Presipitan b 500 µl 1000 µl - 200 µl - 500 µl 2. Larutan dicampur dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25 ˚c kemudian disentrifugasi selama 2 menit 10000 g. 3. Supernatant dipisahkan dalam 1 jam dan diperiksa dengan menggunakan human cholesterol liquicolor. e Prosedur pemeriksaan cholesterol Universitas Sumatera Utara 1. Larutan disiapkan dengan komposisi Blanko Standar Sampel Aqua Destilata Standar Supernatant HDL HCL 100 µl - - 1000 µl - 100 µl - 1000 µl - - 100 µl 1000 µl 2. Campurkan larutan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25 ˚C. 3. Ukur nilai absorbansi dengan panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit. Bandingkan nilai absorbansi sampel dan standar dengan blanko. a. Kalkulasi Kadar kolesterol HDL = 150 x Absorbansi sampel mgdl Absorbansi standar f Pemeriksaan Trigliserida Pemeriksaan trigliserida dilakukan dengan teknik kimiawi menggunakan reaksi enzimatis gliserol phosphate oxidase- peroxidase phenol4-aminoantipyrine metode GPO-PAP . a Prinsip pemeriksaan Trigliserida ditentukan setelah hidrolisis enzymatic dengan lipoprotein lipase. Indicator quinoneimine terbentuk dari 4 aminoantipyrine dan 4-chlorophenol oleh hydrogen peroxidase dibawah pengaruh katalitik peroxidase. Reaksi kimia yang terjadi dalam pemeriksaan ini adalah : Universitas Sumatera Utara HЇOЇ+4-aminoantypyrine peroxidase quinoneimine+HCL+HЇO+4 Chlorophenol b Komposisi Reagent 15 ml; 100 ml atau 250 ml monoreagent Pipet buffer pH 7,5 50 mmoll 4 chlorophenol 5 mmoll 4 aminophenazone 0,25 mmoll Magnesium ions 4,5 mmoll ATP 2 mmol Lipase ≥1300 Il Peroxidase ≥500 Ul Glycerol kinase ≥400 Ul Glycerol 3 phosphate oxidase ≥1500 Ul Sodium azide 0,05 Standar Triglycerides 200 mg c Specimen yang digunakan adalah serum d Prosedur 1. Larutan disiapkan dengan komposisi ; Blanko Sampel standar Sampelstandar Reagent - 1000 µl 10 µl 1000 µl Universitas Sumatera Utara 2. Campurkan larutan dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 20- 25 ˚C. Ukur absorbansi sampel dan standard dan dibandingkan dengan blanko dengan panjang gelombang 500 nm dalam waktu 60 menit. e Kalkulasi Trigliserida mgdL = 200 Absorbansi sampel mgdl Absorbansi standar g Pengukuran kadar estradiol Pengukuran kadar estradiol menggunakan The AxSYM Estradiol assay berdasarkan pada teknologi mikropartikel Enzyme Immunoassay MEIA. 1. Prinsip pemeriksaan SAMPLING CENTER Micropartikel dalam kit telah dilapisi anti estradiol. Sampel Anti- Estradiol coated Microparticles, Estradiol Assay Buffer dan Line Diluent Solution 4 dicampurkan dalam sumur yang sama dan membentuk campuran reaksi. Estrogen : konyugasi Alkaline Phosphatase ditambahkan ke sumur kedua. Kemudian segera dipindahkan ke Pusat Pengolahan . Pipetting lebih lanjut dilakukan di Pusat Pengolahan dengan Probe Processing . Processing center a. Campuran reaksi pada proses inkubasi . Estradiol dalam sampel berikatan dengan anti - estradiol pada mikropartikel membentuk kompleks antigen-antibodi . Universitas Sumatera Utara b. Setelah inkubasi , aliquot campuran reaksi dipindahkan ke Matrix Cell. Mikropartikel berikatan secara irreversibel ke matrixs fiber glass . c. Setelah matrix cell dicuci untuk menghilangkan substans yang tidak berikatan, Estrogen : konyugasi Alkaline Phosphatase kemudian dibagikan ke dalam Matrix Sel dan diinkubasi . d. Steroid dari konyugasi berikatan dengan tempat yang tersedia pada micropratikel yang sudah dilapisi anti estradiol. Kemudian Matrix Sel dicuci kembali untuk menghilangkan bahan yang tidak terikat . e. Substrat : 4 - Methylumbelliferyl fosfat , ditambahkan ke dalam Matrix Sel dan fluorescent yang terbentuk diukur dengan MEIA optical assembly 2. Alat dan bahan Alat : kulkas freezer, centrifuge, Abbot AxSYM System, matrix cell, Vortex, mikropipet, tabung reaksi, sample cup. 3. Bahan : a. Sampel beku yang tersimpan pada suhu – 20 ˚C b. Reagen 1. AxSYM Estradiol Reagent Pack 7A63-20 a. 1 Botol 12,1 mL Estrogen : alkaline fosfat terkonyugasi pada TRIS buffer dengan bovine stabilizer . Konsentrasi Minimum : 0,5 mg mL botol reagent 1 Universitas Sumatera Utara b. 1 Botol 5,1mL Anti - Estradiol antibody poliklonal kelinci dilapisi micropartikel TRIS buffer dengan bovinestabilizer . botol reagen 2. c. 1 Botol 5,5 mL Estradiol Assay Buffer . Citrate glysine buffer yang berisi releasing agen dan surfaktan . botol reagen 3 d. 1 Botol 20 mL Spesimen Pengencer yang mengandung Tris buffer dengan bovine stabilizer . botol reagen 4. 2. AxSYM estradiol master calibrator 7A63-30 2 Botol masing-masing 4 mL AxSYM Estradiol master Calibrator . berisi TRIS buffer dengan bovine stabilizer 3. AxSYM estradiol standart calibrator A63-01 4. AxSYM estradiol control 7A63-10; 3 Botol 8 mL masing-masing AxSYM Estradiol Kontrol mengandung estradiol pada TRIS buffer dengan bovine stabilizer 5. Reagensia lain : a. AxsYM probe cleaning solution 9A35-049A35-05 : 2 botol 220 mL masing-masing berisi 2 Tetraethylammonium Hydroxide TEAH. b. Solution 1 MUP 8A47-04 4 Botol 230 mL masing-masing berisi 4-Methylumbelliferyl Phosphate , 1.2 mM, dalam AMP buffer. Pengawet : Sodium Azide. c. Solution 3 Matrix Cell Wash 8A81-04 4 Botol 1000 mL masing- masing berisi 0.3 M Sodium Chloride dalam TRIS Buffer. Pengawet: Sodium Azide dan Antimicrobial Agents. Universitas Sumatera Utara d. Solution 4 Line Diluent 8A46 1 botol 10 L berisi 0.1M Phosphate buffer. Pengawet: Sodium Azide dan Antimicrobial Agent. e. AxSYM probe cleaning solution 9A35-05 4. Prosedur pemeriksaan estradiol a. Sebelum prosedur uji, pastikan ketersediaan system Matrix Cell, bulk solution dan waste level sudah sesuai. b. Serum beku dikeluarkan dari freezer agar mencair di suhu ruangan. Specimen diaduk seluruhnya dengan vortex dengan kecepatan rendah dan disentrifugasi pada setiap siklus pembekuan dan pencairan. c. Sampel dimasukan kedalam sampel CUP minimal 196 µl d. Masukkan reagen pack di carose reagen e. Masukkan sampel ke carose sesuai dengan posisi order yang telah dilakukan sebelumnya. f. Tekan running, klik oke. g. Tunggu masa inkubasi h. Tunggu hasil pemeriksaan 5. Hasil AxSYM Estradiol menggunakan empat Curva Parameter Logistic metode fit 4PLC, Y-weighted untuk menghasilkan kurva Standard Kalibrasi. Master Kalibrasi menggunakan Teknik A Rasio untuk menyesuaikan master Curva. Kurva standart kalibrasi estradiol menggunakan kurva semi log. Sumbu horizontal X berupa kosentrasi estradiol dalam skala lograitmik dan sumbu Universitas Sumatera Utara vertical Y berupa optical density dalam skala linear. Dengan menggunakan skala logaritmik, jarak antara satu titik dengan titik lainnya tidak linear. BBo = Persentase absorbansi standar OD = Optical density Perhitungan konsentrasi estradiol: Konsentrasi sampel = Kurva BBo x Dilution factor. Hasil dari axSYM estradiol adalah dalam satuan pgml. Reference Values : Follicular Phase : 39- 189 pgml a Pengukuran kadar leptin Pengukuran kadar leptin dilakukan dengan metode ELISA Enzyme- linked immunosorbent assay 1 Prinsip pemeriksaan DRG leptin Elisa Kit merupakan solid Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA berdasarkan prinsip sandwich. Sumur microtiter telah dilapisi antibody monoclonal yang akan berikatan dengan antigen Universitas Sumatera Utara spesifik pada molekul Leptin. Specimen yang mengandung leptin diinkubasi pada sumur yang telah dilapisi antibody biotinylated. Terbentuklah kompleks sandwich. Setelah inkubasi, bahan yang tidak terikat dicuci dan kompleks enzyme Steptavidine Peroxidase mendeteksi jumlah Leptin yang terikat. Setelah ditambahakan substrate solution , terbentuklah intensitas warna yang proporsional dengan konsentrasi leptin pada specimen. 2 Reagents a Reagents tersedia 1. Microtiter wells, 12x8 strips, 96 wells;Wells dilapisi dengan anti-Leptin antibody monoclonal . 2. Standard Standard 0-5, 6 vials, lyophilized, 0.5 mL; Konsentrasi : 0 – 2 – 5 – 25 – 50 – 100 ngmL. 3. Kontrol rendah dan tinggi, 2 vials, lyophilized, 0.5 mL. 4. Assay Buffer, 1 vial, 11 mL, siap digunakan. 5. Antiserum, 1 vial, 11 mL, siap digunakan, monoclonal biotinylated anti-Leptin antibody. 6. Enzyme Complex, 1 vial, 11 mL, siap digunakan, horseradish Peroxidase conyugated streptavidin . 7. Substrate Solution , 1 vial, 14 mL, siap digunakan,Tetramethylbenzidine TMB. 8. Stop Solution, 1 vial, 14 mL siap digunakan, Mengandung 0.5 M H2SO4, 9. Wash Solution, 1 vial, 30 mL 40X Koncentrat, Universitas Sumatera Utara b Bahan lain yang dibutuhkan 1. Microplate reader yang mampu mengukur absorbansi pada 450 ± 10 nm 2. Micropipet presisi yang terkalibrasi 3. Absorbent paper. 4. Deionized water aquadest 5. Timer 6. Software untuk analisis data 3 Persiapan Reagen Bawa semua reagensia dan sampel ke tempat dengan suhu ruangan sebelum digunakan. 1. Standar Menyusun kembali isi lyophilized vial standar dengan 0,5 mL Aqua dest dan diamkan minimal selama 10 menit. Goncangkan vial beberapa kali sebelum digunakan. Catatan: Standar yang telah dilarutkan stabil selama minimal 6 minggu pada 2 ° C - 8 ° C. Untuk penyimpanan yang lebih lama dibekukan pada suhu -20 ° C. 2. Kontrol Menyusun kembali kandungan lyophilized dari vial standar dengan 0,5 mL Aqua dest dan diamkan minimal selama 10 menit. goncangkan vial beberapa kali sebelum digunakan. Catatan: Standar yang telah dilarutkan stabil selama minimal 6 minggu pada Universitas Sumatera Utara 2 ° C - 8 ° C. Untuk penyimpanan yang lebih lama dibekukan pada suhu -20 ° C. 3. Wash Solution Tambahkan air deionisasi aquadest pada 30 ml 40 x consentrat wash solution dengan mengencerkan 30 mL konsentrat wash solution dengan 1170 ml aquadest untuk mencapai volume akhir sebesar 1200 ml. Wash Solution yang diencerkan stabil selama 2 minggu pada suhu kamar. 4 Pengumpulan dan Persiapan Spesimen 1. Pengumpulan specimen. Specimen yang digunakan dalam pengujian ini berupa plasma. darah diambil dengan venipuncture. Spesimen harus ditutup dan dapat disimpan sampai 24 jam pada 2 ° C - 8 ° C sebelum pemeriksaan. Spesimen untuk pemeriksaan dalam waktu yang lama dibekukan pada suhu -20 ° C. sebelum pemeriksaan sampel dicairkan dan harus dibolak-balik beberapa kali. 2. Pengenceran Specimen . Jika dalam pemeriksaan awal, spesimen ditemukan melebihi standar tertinggi, spesimen dapat diencerkan dengan Standard 0 dan reassayed seperti yang dijelaskan dalam Prosedur Assay. Untuk perhitungan konsentrasi faktor pengenceran ini harus diperhitungkan. Universitas Sumatera Utara contoh: a Pengenceran 1:10: 10 uL Serum + 90 uL Standard 0 campurkan b Pengenceran 1:100: 10 uL pengenceran. 5 Prosedur pemeriksaan a. Bagikan masing-masing 15 uL Standard, kontrol dan sampel dengan tips ke dalam sumur yang sesuai. b. Bagikan 100 uL Assay Buffer ke setiap sumur. c. Campurkan dengan menyeluruh dalam 10 detik. d. Inkubasi selama 120 menit dalam suhu ruangan tanpa menutupi plate e. Goncangkan isi sumur dengan cepat. f. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution 300 uL per sumur yang telah diencerkan . Keringkan sumur dengan kertas penyerap untuk menghapus sisa tetesan. g. Tambahkan 100 uL antiserum untuk masing-masing sumur. h. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. i. Menggoncang isi sumur dengan cepat j. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution yang telah diencerkan 300 uL per sumur. Keringkan dengan kertas penyerap untuk menghilangkan sisa tetesan. k. Masukkan 100 uL kompleks enzym pada masing-masing sumur dengan baik. l. Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Universitas Sumatera Utara m. Mengguncang isi sumur dengan cepat. n. Bilas sumur 3 kali dengan Wash Solution yang telah diencerkan 300 uL per sumur. Keringkan dengan kertas penyerap untuk menghapus tetesan sisa. o. Tambahkan 100 uL Substrat Solution pada masing-masing sumur dengan baik. p. Inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar. q. Menghentikan reaksi enzimatik dengan menambahkan 50 uL Stop Solution pada masing-masing sumur dengan baik. r. Tentukan absorbansi OD pada 450 ± 10 nm dengan membaca plate mikrotiter. s. Absorbansi dibaca dalam waktu 10 menit setelah menambahkan Stop solution. 6 Perhitungan Hasil a. Menggunakan perhitungan dengan menggunakan soft ware curve expert versi 14. b. Hitung nilai absorbansi rata-rata untuk setiap set standar, kontrol dan sampel pasien. c. Buatlah sebuah kurva standar dengan memplot absorbansi rata-rata yang diperoleh dari masing-masing standar terhadap konsentrasi dengan nilai absorbansi pada vertikal Y axis dan konsentrasi pada horisontal X axis masing-masing dalam skala Logaritma. Kurva standart. Universitas Sumatera Utara d. Menggunakan nilai absorbansi rata-rata masing-masing sampel untuk menentukan konsentrasi yang sesuai dari kurva standar. e. Hasil di IFU telah dihitung secara otomatis menggunakan 4 PL 4 Parameter Logistik curve fit: 4 metode otomatis. f. Software yang digunakan untuk menganalisa data adalah program Curve expert versi 1,4. g. Konsentrasi sampel dapat dibaca langsung dari kurva standar. Sampel dengan konsentrasi yang lebih tinggi dari standar tertinggi diencerkan terlebih dahulu. Untuk perhitungan konsentrasi, dilution factor ini harus dimasukkan dalam perhitungan. b. Menggunakan Perhitungan Parallel Line Assay PLA Perhitungan dengan metode parallel line pada penelitian ini dilakukan pada 3 tiga sampel sebagai pembanding dengan 2 dua metode lainnya. Pada metode ini standar didilusi sebanyak 2 x dilusi secara serial dari konsentrasi tertinggi 50 ngmL ,25 ngmL dan 12,5 mL untuk menggambarkan kurva standar dan sampel. Sampel juga diencerkan secara serial N,12 dan ¼. Kurva standar dan sampel Universitas Sumatera Utara harus sejajar dan dibuat pada kertas double Logaritma. Logaritma konsentrasi ditunjukkan pada sumbu horizontal x, sedangkan optical density OD ditunjukkan pada sumbu vertical y. Logaritma konsentrasi sampel diperoleh dengan cara interpolasi nilai OD sampel terhadap kurva standar. Gambaran Kurva Standar dan sampel pada metode Parallel Line Assay: Universitas Sumatera Utara c. Menggunakan perhitungan manual dengan rumus 1. Hitung nilai absorbansi rata-rata untuk setiap set standar, kontrol dan sampel pasien 2. Perhitungan manual untuk menentukan konsentrasi samprl dilakukan dengan menggunakan persamaan matematika yang didapatkan dari nilai kurva standar yang dibuat dengan menggunakan program excel 2007: Y= fx F x = m log 10 x + b Dimana : y = optical density x = Konsentrasi leptin m = Slope b =intercept Kurva standar digambarkan pada kertas semi-logaritmik dimana x berupa konsentrasi dalam skala linear dan y adalah optical density OD dalam skala logaritmik. Range nilai normal pemeriksaan leptin : Female : 7.36 ± 3,73 3,63-11,09 Melihat berbedanya hasil perhitungan ketiga metode ini, analisis data kadar leptin pada penelitian ini diputuskan menggunakan hasil perhitungan dengan metode manual dengan pertimbangan hasil perhitungan dengan metode ini paling mendekati nilai hasil perhitungan dengan metode parallel line assay yang diakui sebagai cara yang memberikan hasil yang paling mendekati hasil sebenarnya dari analisa parameter dimana kurva konsentrasi versus OD berbentuk sigmoid Lean et al,1978. Perhitungan menggunakan metode PLA pada keseluruhan sampel pada penelitian ini tidak dilakukan disebabkan oleh terbatasnya dana penelitian. Sedangkan perhitungan dengan menggunakan soft Universitas Sumatera Utara ware curve expert menunjukkan hasil yang terlalu tinggi mencapai 3-4 kali lipat bahkan untuk kadar leptin bagi responden yang berada pada katagori normal. Perbandingan hasil perhitungan ketiga metode ini dapat dilihat pada tabel dibawah ini. No Sampel Katagori Perhitungan Soft Ware PLA Manual 1 Normal 17.78 10.5 4.68 2 Overweight 33.28 16.5 9.25 3 Obesitas 42.36 25.00 12.08

3.9 Analisis Data