Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Optimasi dan Analisis Data

19

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni yang bersifat eksploratif menggunakan metode desain faktorial dengan dua faktor dan dua level untuk mendapatkan sediaan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek yang memenuhi persyaratan sifat fisik dan stabilitas fisik gel.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah CMC Na level rendah dan level tinggi dan propilen glikol level rendah dan level tinggi. b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik gel daya sebar dan viskositas dan stabilitas fisik gel pergeseran viskositas setelah penyimpanan selama 48 jam dan 4 minggu. c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi dan wadah penyimpanan selama 48 jam dan 4 minggu, kecepatan putar, lama pencampuran, alat - alat penelitian, habitat tumbuh tanaman cocor bebek, umur tanaman cocor bebek, waktu panen daun cocor bebek, berat hewan uji, umur hewan uji, jenis kelamin hewan uji, dan galur hewan uji. d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu ruangan, kelembaban ruangan, dan kondisi patofisiologis hewan uji.

2. Definisi Operasional

a. Gel anti-inflamasi adalah sediaan semipadat yang mempunyai efek farmakologi mengurangi gejala-gejala inflamasi secara topikal. b. Ekstrak daun cocor bebek adalah hasil ekstraksi daun cocor bebek dengan metode maserasi selama 48 jam menggunakan etanol, kemudian dilakukan penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 55 o C dan waterbath pada suhu 70 o C selama 3 jam dengan pengadukan secara berkala 30 menit sekali. c. Gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek adalah sediaan semipadat yang mengandung zat aktif dari ekstrak daun cocor bebek Kalanchoe pinnata Lam. yang mempunyai efek farmakologi mengurangi gejala- gejala inflamasi secara topikal. d. Gelling agent adalah komponen dalam sediaan gel yang dapat membentuk jaringan struktural gel sehingga mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas fisik gel, dalam penelitian ini dilakukan optimasi terhadap gelling agent CMC Na. e. Humektan adalah komponen yang berfungsi sebagai pelembab untuk sediaan gel, dalam penelitian ini dilakukan optimasi terhadap humektan propilen glikol. f. Sifat fisik dan stabilitas fisik gel adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui kualitas sediaan gel, dalam penelitian ini sifat fisik sediaan gel meliputi daya sebar dan viskositas gel sedangkan stabilitas fisik meliputi pergeseran viskositas gel setelah penyimpanan 48 jam dan 4 minggu. g. Desain faktorial adalah metode optimasi yang digunakan untuk mengetahui efek yang lebih dominan dalam mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas fisik sediaan gel dengan analisis hasil secara statistik menggunakan program R versi 3.1.2. h. Faktor adalah variabel yang diteliti pada suatu penelitian, dalam penelitian ini digunakan 2 faktor yaitu CMC Na sebagai faktor A dan propilen glikol sebagai faktor B. i. Level adalah tetapan atau nilai dari suatu faktor yang dinyatakan secara numerik. Level rendah CMC Na 6 gram dan level tinggi CMC Na 7,5 gram, sedangkan level rendah propilen glikol 20 gram dan level tinggi propilen glikol 30 gram. j. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya dan dapat dihitung secara kuantitatif, dalam penelitian ini adalah hasil uji sifat fisik viskositas dan daya sebar. k. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan adanya variasi level dan faktor. l. Viskositas adalah ketahanan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek untuk mengalir setelah diberi gaya. m. Daya sebar adalah diameter penyebaran tiap 1 gram gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek selama 1 menit dengan pemberian beban 125 gram pada alat uji daya sebar. n. Pergeseran viskositas adalah selisih viskositas gel antiiinflamasi ekstrak daun cocor bebek setelah penyimpanan setelah 4 minggu dengan viskositas gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek setelah 48 jam pembuatan pada suhu kamar. o. Area optimum adalah area komposisi gelling agent CMC Na dan humektan propilen glikol yang menghasilkan gel yang mempunyai sifat fisik dan stabilitas fisik yang baik. p. Contour plot adalah grafik yang digunakan untuk memprediksi area optimum formula sediaan gel yang memenuhi parameter sediaan gel yang baik. q. Superimposed contour plot adalah penggabungan contour plot daerah optimum dari respon viskositas dan daya sebar.

C. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun cocor bebek kebun obat Universitas Sanata Dharma, aquadest kualitas farmasetis, CMC Na kualitas farmasetis, propilen glikol kualitas farmasetis, metil paraben kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas farmasetis, etanol 70 kualitas farmasetis, suspensi karagenan-salin 1, Voltadex ® , dan tikus jantan galur Sprague Dawley yang berumur 2-3 bulan dengan berat 150-250 gram.

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, mixer Maspion MT-1150, blender, pompa vakum, corong Buchner, maserator, Viskometer Rion seri VT 04 RION-JAPAN, stopwatch, waterbath, neraca analitik, oven, vacuum rotary evaporator, pH stick, alat uji daya sebar, dan jangka sorong digital.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman Cocor Bebek Kalanchoe pinnata Lam.

Determinasi tanaman cocor bebek dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Tujuan dilakukan determinasi adalah memastikan kebenaran tanaman yang digunakan oleh peneliti yaitu Kalanchoe pinnata Lam.. Determinasi dilakukan menggunakan buku Flora of Java Spermatophytes only Backer dan van der Brink, 1963.

2. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek

a. Pengumpulan dan cara panen daun cocor bebek. Bibit tanaman cocor bebek diperoleh dari tempat budidaya Merapi Farma Kaliurang, Yogyakarta. Tanaman cocor bebek dibudidayakan di Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan. Pemanenan daun dilakukan pada umur tiga bulan. Daun dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada daun. Daun yang telah dicuci diangin-anginkan kemudian dikeringkan menggunakan pengeringan udara pada tempat teduh dilanjutkan dengan pengeringan oven sampai daun benar-benar kering, ditandai dengan mudah dipatahkan atau mudah hancur bila diremas. Simplisia yang sudah kering diserbuk menggunakan blender kemudian simplisia diayak menggunakan ayakan mesh 40. b. Pembuatan ekstrak daun cocor bebek. Metode ekstraksi dimodifikasi dari teknik isolasi senyawa ekstrak etanol daun cocor bebek oleh Nwose 2013. Modifikasi metode dilakukan pada tahap penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator dan pelarut etanol 70 yang digunakan. Serbuk daun cocor bebek dimaserasi dengan pelarut etanol 70 dengan perbandingan 2:5 selama 48 jam. Pemisahan serbuk dan maserat dilakukan menggunakan corong Buchner dan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Bagian serbuk disari lagi dengan pelarut etanol dan dimaserasi kembali selama 48 jam. Hasil penyarian dicampur dan diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 55 o C. Pelarut yang tersisa diuapkan kembali pada cawan porselin di atas waterbath dengan suhu 75 o C selama 3 jam dengan pengadukan berkala 30 menit. c. Uji kuantitatif kandungan ekstrak daun cocor bebek. Uji kuantitatif terhadap hasil ekstrak daun cocor bebek dilakukan untuk mengetahui kadar flavonoid pada ekstrak daun cocor bebek. Pengujian kadar flavonoid dilakukan oleh Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM LPPT UGM. Uji flavonoid dilakukan dengan membuat kurva baku menggunakan standar quersetin, dilanjutkan dengan uji flavonoid pada sampel ekstrak daun cocor bebek menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 510 nm.

3. Optimasi formula gel

a. Formula. Formula yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada formula gel luka bakar ekstrak daun cocor bebek Hasyim dkk., 2012 Tabel II. Formula gel untuk luka bakar Bahan Komposisi bv Ekstrak daun cocor bebek 2,5 Carbopol 0,6 Trietanolamin 0,81 Gliserin 25 Propilen glikol 5 Metil paraben 0,18 Etanol 70 0,5 Aquadest ad 100 Formula tersebut dimodifikasi pada komposisi gelling agent dan humektan menjadi formula baru pada tabel III. Tabel III. Formula gel hasil modifikasi Bahan Formula 1 g Formula a g Formula b g Formula ab g Ekstrak daun cocor bebek 5 5 5 5 CMC Na 6 7,5 6 7,5 Propilen glikol 20 20 30 30 Trietanolamin 1,62 1,62 1,62 1,62 Metil paraben 0,36 0,36 0,36 0,36 Etanol 70 1 1 1 1 Aquadest 162 162 162 162 Keterangan tabel: 1 = formula dengan faktor A pada level rendah 6 gram dan faktor B pada level rendah 20 gram. a = formula dengan faktor A pada level tinggi 7,5 gram dan faktor B pada level rendah 20 gram. b = formula dengan faktor A pada level rendah 6 gram dan faktor B pada level tinggi 30 gram. ab = formula dengan faktor A pada level tinggi 7,5 gram dan faktor B pada level tinggi 30 gram. b. Pembuatan gel. CMC Na dikembangkan terlebih dahulu dalam 100 gram aquadest dengan cara menaburkan CMC Na di atas aquadest campuran 1, pengembangan CMC Na dilakukan selama 24 jam. Metil paraben dilarutkan menggunakan etanol 70 dan propilen glikol campuran 2. Campuran 1 dan 2 dicampur dan ditambahkan ekstrak daun cocor bebek kemudian dilakukan proses mixing dengan mixer dengan skala putar 1 selama 5 menit. Trietanolamin ditambahkan pada saat proses mixing pada menit ke-1 untuk mengatur pH sediaan gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek.

4. Uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel

a. Uji organoleptis dan pH. Uji organoleptis dan pH sediaan dilakukan pada penyimpanan 48 jam dan 4 minggu. Sediaan gel ekstrak daun cocor bebek yang telah diformulasi dilakukan pengamatan fisik meliputi bau, warna, homogenitas, dan pH sediaan. Pengukuran pH menggunakan indikator pH pH stick dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan gel kemudian warna yang dihasilkan dibandingkan dengan warna standar pada pH stick. b. Uji viskositas. Uji viskositas dilakukan 48 jam setelah formulasi gel. Masing-masing formula gel ditentukan viskositasnya menggunakan alat Viskometer Rion seri VT 04. Ukuran paddle yang digunakan pada skala 2 rentang viskositas 100-4000 dPas. Cara pengujiannya yaitu gel dimasukkan ke dalam cup sampai terisi ¾. Paddle dipasang tegak lurus pada Viskometer, kemudian cup dipasang dan rotor dinyalakan. Nilai viskositas gel dapat diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. c. Uji pergeseran viskositas. Pergeseran viskositas gel ekstrak daun cocor bebek diketahui dengan menghitung persentase perubahan viskositas gel setelah penyimpanan selama 4 minggu. Berdasarkan penelitian Yuliani 2010, rumus untuk menghitung persen pergeseran viskositas adalah: d. Uji daya sebar. Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah 48 jam pembuatan. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara gel ditimbang 1 gram kemudian diletakkan di tengah lempeng bulat berskala. Kaca bulat lain dan pemberat diletakkan di atas gel tersebut sehingga berat kaca bulat dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya Garg dkk., 2012.

5. Uji aktivitas anti-inflamasi dengan metode carrageenan-induced paw

edema a. Penyiapan hewan uji. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galur Sprague Dawley yang berumur 2-3 bulan dengan berat 100-200 gram. Tikus dipuasakan 12 jam sebelum pengujian. b. Pembuatan larutan NaCl 0,9. Sebanyak 0,225 mg NaCl ditimbang kemudian dilarutkan dengan aquadest di dalam labu takar 25 ml. c. Pembuatan suspensi karagenan-salin 1. Sebanyak 0,1 g karagenan ditimbang kemudian dilarutkan dengan larutan NaCl 0,9 di dalam labu takar 10 ml. d. Perlakuan hewan uji. Hewan uji dibagi menjadi 3 kelompok masing- masing terdiri dari 3 ekor tikus, yaitu: 1 Kelompok kontrol negatif injeksi suspensi karagenan-salin 1. Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital sebelum diinjeksi suspensi karagenan-saline 1 secara suplantar dinyatakan sebagai Yo. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 sebelum injeksi suspensi karagenan- salin 1, 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-salin 1. 2 Kelompok kontrol positif gel Voltadex ® . Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital dinyatakan sebagai Yo, setelah itu dioleskan gel Voltadex ® . Satu jam kemudian, telapak kaki kiri belakang diinjeksi 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1 secara sub plantar. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 sebelum pengolesan gel Voltadex ® , 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-salin 1. 3 Kelompok perlakuan gel ekstrak daun cocor bebek formula optimum. Telapak kaki kiri belakang tikus diukur menggunakan jangka sorong digital dinyatakan sebagai Yo, setelah itu dioleskan gel ekstrak daun cocor bebek. Satu jam kemudian, telapak kaki kiri belakang diinjeksi 0,5 ml suspensi karagenan-salin 1 secara sub plantar. Pengukuran ketebalan telapak kaki tikus dilakukan pada menit ke-0 sebelum pengolesan gel ekstrak daun cocor bebek, 30, 60, 120, 180 setelah injeksi suspensi karagenan-salin 1. d. Pengukuran persen penghambatan edema. Analisis hasil dilakukan dengan mengukur ketebalan telapak kaki tikus menggunakan jangka sorong digital. Setelah itu dihitung nilai edema tiap waktu persamaan 2, nilai AUC total masing-masing perlakuan persamaan 3 dan didapatkan persen penghambatan edema persamaan 4. Nilai edema masing-masing perlakuan tiap jam dihitung dengan rumus: Yu = Yt –Yo ........................................................................................ 2 Keterangan: Yu = edema kaki tikus pada waktu tertentu mm Yt = tebal kaki tikus pada waktu tertentu setelah diradangkan dengan suspensi karagenan-salin 1 mm Yo = tebal kaki tikus sebelum diradangkan dengan suspensi karagenan-salin 1 mm Taufiq, Wahyuningtyas, dan Wahyuni, 2008. Nilai AUC total masing-masing perlakuan dengan rumus: ...................................................... 3 Keterangan: = area dibawah kurva dari jam ke-0 sampai jam ke-3 mm.jam = edema telapak kaki pada jam ke-n-1 mm = edema telapak kaki pada jam ke-n mm = jam ke-n jam = jam ke-n-1 jam Taufiq dkk., 2008. Persen penghambatan edema dihitung dengan rumus: ........ 4 Keterangan: = rata – rata kontrol negatif mm.jam = masing-masing tikus pada kelompok yang diberi perlakuan mm.jam Taufiq dkk., 2008.

F. Optimasi dan Analisis Data

Data hasil sifat fisik dan stabilitas gel dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial untuk mengetahui efek dari CMC Na, propilen glikol, dan interaksi antara CMC Na dan propilen glikol. Analisis menggunakan pendekatan desain faktorial untuk menghitung koefisien b , b 1 , b 2, b 12 sehingga didapatkan persamaan Y = b + b 1 X 1 + b 2 X 2 + b 12 X 1 X 2 . Persamaan tersebut kemudian dibuat contour plot sifat fisik gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek. Masing-masing contour plot digabungkan menjadi superimposed contour plot untuk mengetahui area komposisi optimum CMC Na dan propilen glikol terbatas pada level yang diteliti. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program R versi 3.1.2 dengan uji statistik yaitu uji Shapiro-Wilk yang digunakan untuk mengetahui normalitas distribusi data. Data dapat dikatakan terdistribusi normal jika mempunyai p-value lebih dari 0,05. Jika distribusi data normal maka dilanjutkan dengan uji Levene untuk mengetahui kesamaan variansi tiap populasi. Data dapat dikatakan memiliki kesamaan variansi jika mempunyai p-value lebih dari 0,05. Jika data memiliki kesamaan variansi maka dapat dilanjutkan dengan uji two way ANOVA. Uji ANOVA digunakan untuk mengetahui signifikansi efek dari CMC Na, propilen glikol dan interaksi keduanya sehingga dapat diketahui faktor dominan yang mempengaruhi sifat fisik dan stabilitas gel anti-inflamasi ekstrak daun cocor bebek. Faktor dikatakan berpengaruh jika nilai p-value kurang dari 0,05 dengan taraf kepercayaan 95. 32

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Cocor Bebek Kalanchoe pinnata Lam.

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi tanaman mengacu pada buku Flora of Java Spermatophytes only Backer dan van Der Brink, 1963. Determinasi dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri tanaman cocor bebek dengan kunci determinasi. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman tersebut merupakan tanaman cocor bebek dengan nama latin Kalanchoe pinnata Lam.. Hasil determinasi dinyatakan dalam bukti tertulis surat keterangan determinasi yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Lampiran 1.

B. Pembuatan Ekstrak Daun Cocor Bebek

1. Pengumpulan dan cara panen daun cocor bebek

Tanaman cocor bebek yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Merapi Farma Kaliurang dalam bentuk bibit tanaman dan dibudidayakan di satu tempat tumbuh yaitu Kebun Obat Universitas Sanata Dharma Kampus III Paingan. Pembudidayaan tersebut dilakukan untuk mengendalikan variabel pengacau yang mungkin terjadi pada saat penanaman tanaman cocor bebek seperti habitat tumbuh, iklim, keadaan tanah, dan pemeliharaan tanaman. Tanaman cocor bebek dipanen daunnya pada umur tiga bulan sebelum tanaman berbunga.