20
ditiothreitol akan membantu mendenaturasi protein melalui pemutusan ikatan disulfida pada protein sehingga memecahnya menjadi subunit-subunit protein. Akibatnya, mobilitas elektroforetik dari
kompleks detergen-polipeptida hanya merupakan fungsi dari berat molekul protein Garfin 1990. Penggunaan buffer dalam elektroforesis gel dapat digunakan dengan dua sistem, yaitu kontinyu
homogenous dan diskontinyu multiphasic Copeland 1994. Perbedaan mendasar pada sistem diskontinyu adalah penggunaan dua gel dalam satu slab, yaitu stacking gel dan separating gel. Buffer
dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua jenis gel tersebut berbeda Boyer 1993. Pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid yang lebih rendah ukuran
pori besar sedangkan pada separating gel digunakan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid yang tinggi ukuran pori kecil Wilson dan Walker 2000. Hal ini akan menghasilkan pemisahan
yang baik dengan pita yang tajam karena protein terkonsentrasi pada stacking gel dan mengalami resolusi yang tinggi pada separating gel.
3. Interpretasi Pita Protein
Gel hasil elektroforesis menunjukkan pita-pita protein dengan berat molekul yang berbeda. Protein dengan berat molekul yang lebih besar akan tertahan diatas, sedangkan protein dengan berat
molekul yang lebih kecil akan berada dibawah. Penentuan berat molekul pita protein sampel berdasarkan pita protein marker yang digunakan dapat menggunakan persamaan regresi antara
mobilitas relatif Rf protein marker dengan logaritma dari berat molekul marker yang telah diketahui. Nilai Rf tersebut dirumuskan sebagai :
jarak migrasi protein Persamaan regresi marker tersebut dapat digunakan untuk menentukan berat molekul pita
protein sampel dengan y = log BM protein dan x = nilai Rf pita protein. Contoh persamaan regresi marker dapat dilhat pada Gambar 17.
Gambar 17. Contoh persamaan regresi marker Interpretasi pita protein berdasarkan berat molekul ini umumnya dibandingkan dengan profil
protein sejenis yang berasal dari pustaka lain. Profil protein kedelai dengan SDS-PAGE baik total protein maupun hasil pengisolasian protein 11S dan 7S sudah banyak dipublikasikan. Proses isolasi
protein 11S dan 7S yang sering digunakan adalah metode Thanh dan Shibasaki 1976. Hasil publikasi Mujoo et al. 2003 mengenai profil protein isolasi 11S dan 7S dapat dilihat pada Gambar 18.
21
Gambar 18. Profil protein 11S dan 7S dari tujuh varietas kedelai dengan SDS-PAGE Angka ganjil = 11S dan angka genap = 7S
Berdasarkan profil protein isolasi 11S dan 7S tersebut dapat digunakan untuk menginterpretasikan pita protein sejenis. Gambar diatas menunjukkan baik protein 11S maupun 7S
memiliki beberapa pita protein yang sama dengan intensitas yang berbeda. Sehingga penentuan subunit pada masing-masing fraksi protein berdasarkan pita protein yang dominan pita yang lebih
tebal. Dimana protein 11S memiliki subunit golongan Asam A
1
, A
2
,A
3
, A
4
, A
5
dan Basa B
1
,B
2
,B
3
,B
4
dan protein 7S memiliki subunit α΄, α dan . Namun berat molekul subunit-subunit pada protein 11S maupun 7S merupakan suatu kisaran, sehingga ada beberapa literatur yang
menyatakan berat molekul yang berbeda-beda.
22
III.
METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
