18
Umumnya rantai polipeptida tidak terikat dalam kompleks biologis oleh ikatan kovalen, kecuali ikatan disulfida, dan ikatan yang dibentuk oleh transglutaminase TAG. TAG menginisiasi
terbentuknya ikatan amida yang secara kimia tak dapat dibedakan dari ikatan peptida. Ikatan ini tidak dapat dipecah selain dengan mendegradasi protein tersebut menjadi bentuk asam aminonya.
Sementara itu, ikatan disulfida merupakan ikatan kovalen yang dapat dengan mudah dirusak tanpa harus mendegradasi protein. Sebagai ikatan kovalen, ikatan disulfida dapat diputus secara kimiawi,
namun reagen perusak harus dapat masuk dan kontak dengan ikatan disulfida tersebut. Sementara itu, ikatan disulfida terletak di dalam struktur protein sehingga dibutuhkan proses denaturasi untuk
membuka sebagian struktur protein unfold dan reagen perusak pun dapat menyerang ikatan disulfida. Reagen perusak yang dapat memutus ikatan disulfida, antara lain merkaptoetanol,
tiogliserol, sisteamin, ditiotreitol DTT, atau ditioeritritol DTE Rabilloud 1996. Prinsip dasar memutus ikatan disulfida adalah dengan menambahkan tiol bebas secara berlebih.
Alkil tiol seperti 2-mercaptoethanol biasanya digunakan pada konsentrasi yang cukup tinggi 0.2 M untuk memastikan kecukupan penggantian tiol yang berasal dari protein Rabilloud 1996.
Mekanisme pemutusan ikatan disulfida dapat dilihat pada Gambar 15.
Gambar 15. Mekanisme pemutusan ikatan disulfida dengan tiol bebas, a reduksi dengan monotiol bebas 2-mercaptoethanol dan b reduksi dengan siklik ditiol DTT Rabilloud 1996
2. Teknik Elektroforesis Dalam Analisis Protein
Elektroforesis didefinisikan sebagai migrasi molekul atau partikel bermuatan di dalam larutan atau medium melalui pengaruh medan listrik Nielsen 2003. Migrasi partikel bermuatan tersebut
dapat terjadi karena perbedaan muatan total, ukuran dan bentuk partikel Pomeranz dan Meloan 1994. Metode analisis elektroforesis protein merupakan metode analisis yang memisahkan molekul
protein berdasarkan berat molekulnya Bolag dan Edelstein 1991. Teknik elektroforesis telah banyak digunakan dalam analisis protein untuk menentukan tingkat
kemurnian sampel, berat molekul maupun titik isoelektrik Copeland 1994, untuk menentukan komposisi protein dari suatu produk pangan Nielsen 2003.
19
Pemisahan protein berdasarkan muatannya tergantung pada karakter asam dan basa protein. Hal ini ditentukan oleh jumlah dan jenis rantai samping gugus R yang dapat terionisasi dalam rantai
polipeptida serta pH lingkungan. Pada pH lingkungan yang lebih besar daripada pH isoelektriknya pI, protein akan memiliki muatan negatif sehingga migrasi protein akan menuju anoda yang
bermuatan positif. Sebaliknya, bila pH lingkungan di bawah pI, muatan protein menjadi positif yang membuatnya akan bermigrasi menuju katoda yang bermuatan negatif Autran 1996. Hal inilah yang
menjadi dasar pemisahan protein dengan elektroforesis. Metode elektroforesis protein yang paling umum dan banyak dilakukan adalah SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electropho-resis. SDS-PAGE merupakan teknik elektroforesis dalam sistem buffer diskontinyu yang menggunakan dua tipe gel sebagai medianya,
yaitu stacking gel dan separating gel. Sistem buffer yang diskontinyu membuat sampel terkonsentrasi dalam stacking gel sehingga menghasilkan resolusi yang lebih baik ketika pemisahan protein terjadi di
separating gel Garfin 1990. Skematik Elektroforesis SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 16.
Gambar 16. Skematik electroforesis SDS-PAGE Anonim
b
Gel poliakrilamid dibentuk dari hasil ko-polimerisasi monomer akrilamid CH
2
=CH-CO-NH
2
dengan bantuan senyawa yang bertindak sebagai cross-linking agent yaitu N,N‟-metilen-bisakrilamid
CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2. Mekanisme polimerisasi akrilamid tersebut dikatalisis oleh TEMED tetrametiletilendiamin dan APS amonium persulfat. TEMED akan menyebabkan
pembentukan radikal bebas dari amonium persulfat yang mengakibatkan reaksi pembentukan akrilamid aktif. Akrilamid aktif ini akan bereaksi dengan akrilamid lainnya membentuk rantai polimer
yang panjang. Hasil dari polimerisasi ini adalah terbentuknya gel dengan struktur jala dari rantai akrilamid. Ukuran pori dan jala gel tersebut ditentukan oleh jumlah akrilamid yang digunakan per unit
volumenya dan derajat ikatan silangnya Garfin 1990; Autran 1996. Sodium dodecyl sulfate SDS adalah detergen anionik yang paling umum digunakan dalam
elektroforesis. SDS memiliki dua fungsi, yaitu : 1 untuk memisahkan protein-protein yang beragregasi, hidrofobik atau memiliki kelarutan yang rendah, seperti membran protein; dan 2
memisahkan protein berdasarkan bentuk, ukuran dan berat molekulnya. SDS menyelimuti protein dengan muatan negatif serta mengikat protein dengan rasio yang konstan, yaitu 1.4 g SDS per gram
polipeptida Garfin 1990; Autran 1996. Interaksi SDS dengan protein akan merusak seluruh ikatan non-kovalen protein sehingga
struktur protein akan terbuka. Selanjutnya, penggunaan reducing agent seperti 2-merkaptoetanol atau
20
ditiothreitol akan membantu mendenaturasi protein melalui pemutusan ikatan disulfida pada protein sehingga memecahnya menjadi subunit-subunit protein. Akibatnya, mobilitas elektroforetik dari
kompleks detergen-polipeptida hanya merupakan fungsi dari berat molekul protein Garfin 1990. Penggunaan buffer dalam elektroforesis gel dapat digunakan dengan dua sistem, yaitu kontinyu
homogenous dan diskontinyu multiphasic Copeland 1994. Perbedaan mendasar pada sistem diskontinyu adalah penggunaan dua gel dalam satu slab, yaitu stacking gel dan separating gel. Buffer
dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua jenis gel tersebut berbeda Boyer 1993. Pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid yang lebih rendah ukuran
pori besar sedangkan pada separating gel digunakan buffer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid yang tinggi ukuran pori kecil Wilson dan Walker 2000. Hal ini akan menghasilkan pemisahan
yang baik dengan pita yang tajam karena protein terkonsentrasi pada stacking gel dan mengalami resolusi yang tinggi pada separating gel.
3. Interpretasi Pita Protein
