27
4. Analisis pH Moizuddin et al. 1999
Tingkat keasaman whey hasil koagulasi dan pengepresan curd diukur dengan menggunakan pH meter pada suhu ruang
5. Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford 1976
a. Preparasi pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 ml etanol 95.
Selanjutnya ditambahkan 100 ml asam fosforat 85 dan ditepatkan hingga 1 liter dengan menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1 dan
disimpan dalam botol gelap. b. Pembentukan kurva standar
Sebanyak 100 ul larutan BSA 100-1000 µgml dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian
divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada 5λ5 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 µl akuades ditambahkan 5 ml perekasi Bradford dan diukur dengan
cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
c. Pengukuran sampel
Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford adalah pengikatan pewarna CBBG yang terdapat dalam peraksi Bradford dengan protein yang mengandung
residu asam amino dengan rantai samping aromatik Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin atau bersifat basa Arginin, Histidin dan Leusin membentuk kompleks berwarna biru yang dapat
diukur absorbansinya. Sampel yang digunakan adalah whey hasil koagulasi dan hasil pelarutan protein. Sebanyak 100 µl sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x
10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absrobansinya menggunakan spektrofotometer
SIMADZU UV- β450 UV Vis Spectrofotometer pada 5λ5 nm.
6. Analisis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Laemmli 1970
Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan hasil
pelarutan protein dengan metode Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi dari sampel kacang kedelai giling dan curd kedelai. Tahapan yang harus dilakukan dalam melakukan SDS-PAGE
adalah a pembuatan separating gel; b pembuatan stacking gel; c preparasi dan injeksi sampel; d running SDS-PAGE; e pewarnaan gel; f destaining gel; dan g penentuan berat molekul
protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS- PAGE dapat dilihat pada Lampiran 1.
a Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet ke dalam gelas piala,
kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat. Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl APS
10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan
28
perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas
lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit.
b Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Akua-biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-maasing sebanyak, 0.67 ml, dan 1.0 ml
dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam
campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking
gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis.
Buffer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100
˚
C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet
dibilas menggunakan akuades setiap kali ingin memesukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7.5 µl protein marker.
d Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye
tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 ml. Kemudian didiamkan selama 20
menit
.
f Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang
pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dengan logaritma dari berat molekul marker yang
telah diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein yang dibandingkan
dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: jarak migrasi protein
29
7. Analisis Gel Electrophoresis