22
III.
METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini yaitu kedelai impor yang diperoleh dari KOPTI Koperasi Produsen Tahu Tempe Indonesia dan koagulan GDL Glucono Delta Lactone
food grade. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis antara lain n-heksana PA, coomassie brilliant blue G-250 CBBG, etanol 95, asam fosforat 85, dan bovine serum albumin BSA, K
2
SO
4
, HgO, H
2
SO
4
pekat, Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O, H
3
BO
3
, HCl, akuades, indikator MR-MB, akrilamid, N,N‟-metilen
bisakrilamid, amonium persulfat APS, sodium dodecyl sulfate SDS, tetrametil-etilendiamin TEMED, glisin, gliserol, bromphenol blue, coomassie brilliant blue R-250, methanol, asam asetat
glasial, akua-biodestilat, standar low molecular weight protein LMW. 2-mercaptoethanol, dan Trishydroxymethylaminomethane.
Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan curd antara lain blender, heater, termometer, panci, kain saring, pencetak curd. Alat-alat yang digunakan untuk analisis adalah alat soxhlet, alat Kjeldahl,
sentrifuge, perangkat alat elektroforesis, tabung Eppendorf, mikropipet, gelas piala, timbangan analitik, pH meter, labu takar, gelas ukur, hot plate, sudip, sarung tangan, spektrofotometer, tabung
reaksi, kuvet, pipet, vortex, alat gelas untuk analisis sensori dan perangkat analisis tekstur TA-XT2i.
B. METODE PENELITIAN
Secara umum, penelitian ini terdiri dari dua tahapan. Tahap pertama merupakan tahap persiapan berupa penguasaan teknik pembuatan curd dan penetapan proses standar pembuatan curd.
Tahap kedua merupakan tahapan penelitian utama. Pada tahap ini dilakukan analisis terhadap bahan baku kacang kedelai serta produk hasil berupa curd dan whey.
1. Penelitian Pendahuluan
Penelitian pendahuluan meliputi tahap penguasaan teknik pembuatan curd dengan mengadopsi metode pembuatan tahu di pabrik tahu loka
l “Diazara Tresna” di daerah Darmaga Bogor. Metode pembuatan curd tersebut telah dilakukan oleh Fahmi 2010, dimana telah
diperoleh jumlah total penambahan air terbaik yaitu dengan perbandingan 1:15 berdasar berat kedelai, tekanan penekan curd sebesar 4.71 gcm
2
dan waktu penekanan selama 30 menit untuk menghasilkan curd yang baik. Pada penentuan proses untuk penelitian utama dilakukan trial and
error terhadap suhu awal koagulasi, waktu koagulasi dan konsentrasi GDL yang diterapkan pada skala laboratorium.
2. Penelitian Utama
Pada tahap ini dilakukan analisis terhadap bahan baku tepung kedelai, curd yang diperoleh melalui standar proses pembuatan curd pada tahapan pertama, serta whey hasil
sampingan produk curd. Analisis yang dilakukan meliputi analisis tekstur curd secara subyektif dan obyektif, analisis kadar protein dengan metode Kjeldahl, analisis kadar air, analisis pH
whey, pelarutan protein, analisis kadar protein Bradford, dan analisis SDS-PAGE. Skema penelitian pada tahap analisis ini dapat dilihat pada Gambar 19.
23
Gambar 19. Skema penelitian utama GDL
0.4, 0.8 dan 1.2
pH dan protein Bradford
Elektroforesis SDS-PAGE
Whey
Analisis Kacang kedelai
Susu kedelai
Curd Tepung kedelai
Analisis Tekstur Penghilangan
Lemak
Obyektif Subyektif
Koagulasi 20 menit pada suhu awal 63 °C dan
83 °C
Analisis Kadar air Pengukuran Kadar
Protein Kjedahl Pelarutan total
protein
filtrat
Analisis Protein Bradford
GEL
Analisis GEL
24
Dilakukan analisis terhadap sampel tepung kacang kedelai yang telah dihilangkan lemaknya. Analisis tersebut meliputi pengukuran kadar protein metode Kjedahl, pelarutan protein tepung kedelai
metode Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi, analisis Bradford ekstrak tepung kedelai, elektroforesis SDS-PAGE dan analisis GEL elektroforesis.
Sebelum proses koagulasi, kacang kedelai diekstrak menjadi susu kedelai dengan mengadopsi pembuatan susu kedelai Fahmi 2010. Skema pembuatan curd dapat dilihat pada Gambar 20.
Gambar 20. Skema pembuatan curd meliputi: a persiapan susu, b persiapan koagulan dan c tahap pembentukan curd Modifikasi metode Fahmi 2010
Pada proses koagulasi, susu kedelai dikoagulasi dengan menggunakan tiga konsentrasi GDL 0.4, 0.8 dan 1.2 dan dua suhu awal koagulasi 63 °C dan 83 °C. Kemudian dilakukan
beberapa analisis terhadap curd yang dihasilkan meliputi, analisis kadar air, analisis tekstur obyektif dan subyektif. Sebelum analisis profil protein curd, pertama-tama curd dihilangkan kandungan
lemaknya dengan cara merendam curd dalam heksan PA dengan perbandingan curd : heksan 1: 4 selama ± 6 jam, heksan dibuang melalui proses sentrifugasi pada kecepatan 12500 rpm selama 5 menit
dan sisa heksan diuapkan disuhu ruang selama ± 2 jam. Curd yang telah bebas lemak dianalisis kadar proteinnya menggunakan metode Kjedahl dan pelarutan protein curd menggunakan metode
Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi. Hasil pelarutan dianalisis kadar proteinnya menggunakan
Kedelai Dicuci dan direndam air 1:3
selama ±6 jam Digiling
Ditambahkan air 1:6 Bubur Kedelai
Dididihkan selama 10 menit sambil diaduk
Disaring Ditambahkan
air 1:4
Dibilas air mendidih 1:5
Susu Kedelai Ampas
a
Koagulan GDL Ditimbang sesuai konsentrasi
yang telah ditentukan 40 gram Dilarutkan dalam 100 ml
aquades Larutan stok GDL
b
c
Susu Kedelai Dipanaskan
63 °C dan 83 °C Dikoagulasi
Didiamkan selama 20 menit Dicetak dan dipress dengan tekanan
4.71 gcm
2
selama 30 menit Curd
Whey Koagulan GDL
kacang kedelai 500g susu kedelai 1200 ml
GDL : 0.4, 0.8 dan 1.2 dari vol. susu kedelai larutan stok GDL 40
25
metode Bradford dan dipisahkan secara elektroforesis SDS-PAGE. Gel elektroforesis dianalisis untuk mengetahui berat molekul BM pita protein, densitas pita protein dan identifikasi pita protein. Whey
yang dihasilkan dari proses pembuatan curd dianalisis pH dan kadar proteinnya menggunakan metode Bradford.
C. PROSEDUR ANALISIS
1. Analisis Kadar Air Metode Oven SNI 1992 yang Dimodifikasi
Sejumlah sampel curd 3-5g dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105
o
C hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus :
Kadar air bb Dimana :
a = berat cawan dan sampel awal g b = berat cawan dan sampel akhir g
c = berat sampel awal g
2. Analisis Kadar Protein Metode Kjeldahl AOAC 1995 yang dimodifikasi
Sejumlah sampel curd 100-250 mg ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1.0 ± 0.1 g K
2
SO
4
, 40 ± 10 mg HgO dan 2 ± 0.1 ml H
2
SO
4
. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu
didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke
dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 8- 10 ml larutan 60 NaOH-5 Na
2
S
2
O
3
ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5 ml H
3
BO
3
dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue MRMB diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H
3
BO
3
. Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ± 15 ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50
ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus :
N ml HCl-ml blanko
mg sampel x N HCl x 14.007 x 100
Kadar protein g
100 g bahan basah N x Faktor Konversi
3. Pelarutan Total Protein Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi
Proses ini merupakan modifikasi dari metode Mujoo et al. 2003 pada beberapa bagian Lampiran 2b.. Proses pelarutan protein yang telah dimodofikasi menggunakan larutan M
buffer tris pH 8.4 yang mengandung 0.02 M 2-mercaptoethanol. Sampel yang digunakan adalah tepung kedelai dan curd berbagai perlakuan yang telah dihilangkan lemaknya terlebih
dahulu halaman 24. Sebanyak 20 mg sampel curd dan tepung kedelai yang telah bebas lemak dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml yang kemudian diekstraksidilarutkan sebanyak 3
tahapan. Pembuatan larutan M dapat dilihat pada Lampiran 2. Skema pelarutan protein dapat dilihat pada Gambar 21.
26
Gambar 21. Skema pelarutan protein metode Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi 20 mg curd bebas lemak
Ditambah 0.5 ml pelarut M
Diinkubasi pada penangas air suhu 80
°
C selama 1 jam vorteks tiap 10 menit selama 1 menit
Disentrifuse 20 menit, 25
°
C, 15000 rpm
Endapan
Diinkubasi pada penangas air suhu 80
°
C selama 1 jam vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Ditambah 0.5 ml pelarut M
Ditambah 0.5 ml pelarut M Endapan
Disentrifuse 20 menit, 25
°
C, 15000 rpm
Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 40 menit vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Disentrifuse 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm
Endapan Filtrat
Dimasukkan ke tabung eppendorf
Divorteks selama 1 menit
27
4. Analisis pH Moizuddin et al. 1999
Tingkat keasaman whey hasil koagulasi dan pengepresan curd diukur dengan menggunakan pH meter pada suhu ruang
5. Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford 1976
a. Preparasi pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 ml etanol 95.
Selanjutnya ditambahkan 100 ml asam fosforat 85 dan ditepatkan hingga 1 liter dengan menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1 dan
disimpan dalam botol gelap. b. Pembentukan kurva standar
Sebanyak 100 ul larutan BSA 100-1000 µgml dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian
divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada 5λ5 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 µl akuades ditambahkan 5 ml perekasi Bradford dan diukur dengan
cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
c. Pengukuran sampel
Prinsip pengukuran kadar protein menggunakan metode Bradford adalah pengikatan pewarna CBBG yang terdapat dalam peraksi Bradford dengan protein yang mengandung
residu asam amino dengan rantai samping aromatik Tirosin, Triptofan dan Fenilalanin atau bersifat basa Arginin, Histidin dan Leusin membentuk kompleks berwarna biru yang dapat
diukur absorbansinya. Sampel yang digunakan adalah whey hasil koagulasi dan hasil pelarutan protein. Sebanyak 100 µl sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x
10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absrobansinya menggunakan spektrofotometer
SIMADZU UV- β450 UV Vis Spectrofotometer pada 5λ5 nm.
6. Analisis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis Laemmli 1970
Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel yang dielektroforesis adalah supernatan hasil
pelarutan protein dengan metode Mujoo et al. 2003 yang dimodifikasi dari sampel kacang kedelai giling dan curd kedelai. Tahapan yang harus dilakukan dalam melakukan SDS-PAGE
adalah a pembuatan separating gel; b pembuatan stacking gel; c preparasi dan injeksi sampel; d running SDS-PAGE; e pewarnaan gel; f destaining gel; dan g penentuan berat molekul
protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS- PAGE dapat dilihat pada Lampiran 1.
a Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet ke dalam gelas piala,
kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat. Campuran kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl APS
10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan
28
perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas
lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit.
b Pembuatan stacking gel
Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Akua-biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-maasing sebanyak, 0.67 ml, dan 1.0 ml
dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam
campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking
gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis.
Buffer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam.
c Preparasi dan injeksi sampel
Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100
˚
C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet
dibilas menggunakan akuades setiap kali ingin memesukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7.5 µl protein marker.
d Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye
tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 ml. Kemudian didiamkan selama 20
menit
.
f Destaining gel
Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang
pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dengan logaritma dari berat molekul marker yang
telah diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein yang dibandingkan
dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: jarak migrasi protein
29
7. Analisis Gel Electrophoresis
Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di dokumentasikan dalam bentuk gambar dengan menggunakan Gel-Doc Bio-rad. Hasil GEL-DOC tersebut kemudian dianalisis densitas
pita proteinnya dengan menggunakan ImageJ 1.42q software dari Wayne Rasband, National Institute of Health, USA http:rsb.info.nih.govij.
8. Analisis Tekstur Curd secara Obyektif
Tekstur curd dianalisis dengan metode Texture Profile Analysis TPA menggunakan alat TA-XT2i. Setting alat TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd dapat dilihat pada Tabel 5. Sampel
curd yang akan diuji merupakan sampel curd yang telah disimpan dalam rendaman air selama 1 malam di dalam lemari pendingin. Satu jam sebelum pengukuran, sampel curd di biarkan dahulu
di suhu ruang. Pengukuran sampel curd dilakukan sebanyak empat kali dari empat titik yang berbeda. Sampel curd yang akan diukur dipotong berbentuk silinder dengan diameter ±3.5 cm.
Sampel dianalisis menggunakan probe P100 dengan diameter 100mm. Parameter yang diukur menggunakan metode TPA adalah kekerasan, kohesivitas dan daya kunyah curd.
Tabel 5. Setting TA-XT2i untuk pengukuran TPA curd
Pre-test speed 1.5 mmsec
Test speed 1.5 mmsec
Post-test speed 1.0 mmsec
Target mode 0 = distance
Unit distance strain
Distance 60
Time 5 sec
Trigger type 0 = Auto force
Unit force grams
Trigger force 20 g
Tare mode 0 = Auto
Interpretasi beberapa parameter tekstur :
Kekerasan menunjukkan besarnya gaya yang diberikan hingga obyek mengalami perubahan bentuk. Tekanan probe yang diberikan terhadap objek, menghasilkan grafik TPA
yang meningkat hingga mencapai batas tertentu dimana objek akan mengalami perubahan bentuk dan pada saat objek hancur, grafik TPA akan menunjukkan pola penurunan. Sehingga parameter
kekerasan dapat diperoleh dari nilai gaya pada puncak tertinggi di kurva pertama. Kohesivitas merupakan rasio usaha yang dibutuhkan untuk menekan pangan pada gigitan
kedua dibandingkan dengan usaha yang dibutuhkan untuk menekan pada gigitan pertama. Luas area dibawah kurva merupakan integral dari waktu t terhadap gayaF yang setara dengan
usaha. Sehingga parameter kohesivitas dapat diperoleh dari rasio luas area dibawah kurva kedua dengan luas area dibawah kurva pertama.
Daya kunyah merupakan besarnya tenaga yang dibutuhkan untuk menghancurkan pangan semi padat menjadi bentuk yang siap ditelan. Parameter daya kunyah dipengaruhi oleh kekerasan
dan kekompakan objek, sehingga merupakan hasil perkalian antara kekerasan dan kohesivitas.
30
Kelengketan merupakan besarnya tenaga yang dibutuhkan untuk mengunyah pangan padat menjadi bentuk yang siap ditelan. Parameter kelengketan merupakan perkalian antara
kekerasan, kohesivitas dan elastisitas.
9. Analisis Tekstur Curd secara Subyektif
Serangkaian uji segitiga dan uji ranking terhadap kekerasan penekanan curd dilakukan dalam beberapa tahap untuk menyeleksi panelis. Dibutuhkan sebanyak 6-18 calon panelis yang
selanjutnya akan diberikan pelatihan mengenai pengujian kekerasan curd menggunakan telunjuk dan ibu jari. Pelatihan yang dilakukan meliputi teknik pengujian, penyamaan persepsi kekerasan,
penentuan sampel referen dan teknik penilaian organoleptik. Dalam proses pelatihan, dilakukan uji rating skala garis 0 = lunak dan 15 = keras sampel tahu komersial terhadap sampel referen
hingga diperoleh konsistensi panelis pada penilaian sampel tahu komersial. Penilaian subyektif terhadap beberapa tahu komersil tersebut dijadikan kurva standar hubungan antara tingkat
kekerasan tahu Hardness dengan penilaian subyektifnya. Selanjutnya, panelis diminta menguji sampel tahu komersil lain yang belum pernah diujikan menggunakan uji rating skala garis.
Kuesioner uji penekanan sampel curd dapat dilihat pada Lampiran 2. Pengolahan data uji penekanan menggunakan bantuan program statistik SPSS 15.0.
D. RANCANGAN PERCOBAAN
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap dengan dua faktor dan dua kali ulangan. Faktor yang digunakan meliputi suhu awal
koagulasi α dan konsentrasi koagulan GDL . Faktor suhu awal koagulasi terdiri atas dua taraf, yaitu suhu 63 °C α1
dan suhu 83 °C αβ, sedangkan konsentrasi koagulan terdiri atas tiga taraf, yaitu 0.4 1, 0.8 N
β, dan 1.β γ. Model matematika untuk rancangan percobaan ini adalahμ Y
ijk
µ + α
i
+
j
+ α
ij
+ Σ
ij
dimana: Y
ijk
respon pada perlakuan α ke-i, perlakuan ke-j, ulangan ke-k µ
= pengaruh rata-rata sebenarnya α
i
= pengaruh perlakuan suhu awal koagulasi ke-i
j
= pengaruh perlakuan konsentrasi koagulan ke-j α
i j
= pengaruh interaksi α ke-i dan ke-j
Σ
ij
= pengaruh acak galat pada perlakuan ke-i kelompok ke-j i
= 1, 2 j
= 1, 2, 3
IV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penelitian Pendahuluan