Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford, 1976

25 diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. c. Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100 o C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas menggunakan akuades setiap kali ingin memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 µl protein marker. d. Running SDS-PAGE Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda. e. Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 ml. Wadah tertutup tersebut kemudian digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit. f. Destaining gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis. g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dan logaritma dari berat molekul marker yang telah diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: Rf = Jarak migrasi protein Jarak migrasi tracking dye

3.2.9 Analisis Densitas Pita Protein

Gel yang didapat dari tahap SDS-PAGE, kemudian didokumentasikan dalam bentuk gambar digital menggunakan alat Gel Doc Bio-Rad. Densitas pita protein yang terlihat dalam gel tersebut kemudian dianalisis menggunakan perangkat lunak ImageJ 1.42q dari Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA http:rsb.info.nih.govij. Melalui perangkat lunak ini, pita protein yang terdapat pada gel elektroforesis dikonversi menjadi grafik. Luas area di bawah grafik merupakan densitas pita protein. Gambar 9 menunjukkan contoh hasil berupa grafik yang didapatkan dari ImageJ 1.42q. Penentuan luas wilayah di bawah grafik juga ditentukan dengan menggunakan software ImageJ 1.42q ini. Rasio luas masing-masing wilayah di bawah grafik terhadap total luas wilayah satu sampel dikalikan dengan seratus persen adalah persentase dari subunit protein atau polipeptida. Persentase ini merupakan nilai komposisi subunit atau polipeptida suatu sampel.