Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford, 1976
25
diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan
mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis
dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. c.
Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl
buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100
o
C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas
menggunakan akuades setiap kali ingin memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 µl protein marker.
d. Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa
sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e. Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 ml. Wadah tertutup tersebut kemudian
digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit. f.
Destaining gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna
ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dan logaritma dari berat molekul marker yang telah
diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: Rf =
Jarak migrasi protein Jarak migrasi tracking dye