22
Kadar protein g
100 g bahan basah
= N × Faktor Konversi
3.2.5 Tahap Penghilangan Lemak
Lemak tahu komersial yang akan dianalisis proteinnya dengan metode Bradford, harus dihilangkan terlebih dahulu lemaknya. Penghilangan lemak ini dilakukan karena lemak dapat
mengganggu proses solubilisasi protein yang ditujukan untuk analisis menggunakan metode elektroforesis SDS-PAGE. Lemak tahu dihilangkan dengan menggunakan larutan non polar.
Penghilangan lemak dalam penelitian ini dilakukan dengan cara penambahan larutan heksan, kemudian diinkubasi semalam, lalu disentrifugasi menggunakan alat sentrifugasi. Lebih lengkapnya
dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Diagram alir penghilangan lemak
3.2.6 Tahap Solubilisasi Protein Tahu Mujoo et al., 2003 yang dimodifikasi
Sejumlah sampel 20 mg tahu bebas lemak dalam tabung eppendorf ditambahkan 0.5 ml pelarut A buffer tris pH 8,4 yang mengandung 0,02 M 2-Mercaptoethanol lalu divortex. Setelah itu
diinkubasikan pada penangas air bersuhu 80
o
C selama 1 jam vortex tiap 10 menit selama 1 menit. Tabung eppendorf kemudian disentrifuse selama 20 menit pada suhu 25
o
C dengan kecepatan 15000 rpm. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lain sebagai stok, dan endapan ditambah 0.5 ml
pelarut A lalu divortex. Endapan yang telah ditambahkan pelarut A diinkubasikan pada penangas air bersuhu 80
o
C selama 1 jam vortex tiap 20 menit selama 1 menit. Tabung eppendorf lalu disentrifuse selama 20 menit pada suhu 25
o
C dengan kecepatan 15000 rpm. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung stok tadi, dan endapan ditambah 0.5 ml pelarut A lalu divortex. Endapan tadi kemudian diinkubasikan
pada penangas air bersuhu 80
o
C selama 40 menit vortex tiap 20 menit selama 1 menit. Endapan 450-500 mg tahu
+ 1 ml heksan dalam tabung Eppendorf 1.5 ml
Inkubasi selama semalam dalam refrigerator
Sentrifugasi 4
o
C, 12500 rpm, 5 menit
Tahu Bebas Lemak
Heksan + lemak
23
yang telah diinkubasi kemudian disentrifuse selama 20 menit pada suhu 25
o
C dengan kecepatan 15000 rpm. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung stok. Lebih lengkapnya dapat dilihat pada Gambar 8.
Supernatan
Supernatan
Supernatan
Gambar 8. Diagram alir ekstraksi protein modifikasi Mujoo et al. 2003
20 mg tahu bebas lemak Ditambah 500 µl larutan Tris
[Trishydroxymethylaminomethane] buffer pH 8.4 which contain 0.02 ε β-mercaptoethanol
Divorteks selama 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 1 jam vorteks tiap 10 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Ditambah 500 µl larutan Tris dan divorteks 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 1 jam vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Ditambah 500 µl larutan Tris dan divorteks 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 40 menit vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Larutan Stok
Kategori