TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN
12
didenaturasikan. Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE dengan detergen anionik, sodium dodecyl sulfate SDS, digunakan untuk memisahkan subunit protein menurut ukurannya. Protein
disolubilisasi dan dipisahkan menjadi subunit-subunit dalam suatu buffer yang mengandung SDS dan reducing agent. Reducing agent, seperti mercaptoethanol atau ditiotreitol, digunakan untuk
mengurangi ikatan disulfida yang terdapat pada suatu subunit protein atau di antara subunit-subunit protein. Protein akan mengikat SDS, yang akan membuatnya menjadi bermuatan negatif, dan
kemudian dipisahkan berdasarkan ukurannya sendiri Nielsen, 2010. SDS akan melapisi protein yang telah terdenaturasi. Pada bentuk terdenaturasi, kebanyakan
protein mengikat SDS dalam rasio berat yang konstan, sehingga protein berakhir dengan memiliki densitas bermuatan yang sama. Di bawah kondisi seperti ini, tingkat migrasi protein dalam medan
listrik tidak lagi tergantung pada muatan yang melekat pada molekul, tetap lebih ditentukan semata- mata oleh ukuran molekul sebagai contoh, protein yang lebih besar akan lebih sangat terhambat
dalam migrasi dalam gel polimer dibandingkan dengan protein yang lebih kecil. Skema dari alat SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 4. Sampel protein akan diinjeksikan melalui sumur pada ujung
atas gel yang kontak, melalui kolam buffer, dengan katoda. Bagian bawah gel juga terhubung dengan anoda. Ketika arus listrik diaplikasikan, protein yang terlapis oleh SDS akan bermigrasi ke bagian
bawah gel, di bawah pengaruh medan listrik yang diberikan Copeland, 1994. Kompleks SDS-protein yang lebih besar akan memiliki mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks SDS-
protein yang lebih kecil.
Gambar 4 . Skema alat SDS-PAGE Jage, 2008
Menurut Boyer 1993, gel yang dibentuk dari polimerisasi akrilamid memiliki beberapa kelebihan positif dalam elektroforesis: 1 memiliki kemampuan pemisahan yang tinggi bagi protein
dan asam nukleat yang berukuran kecil hingga sedang kira-kira hingga 1 × 10
6
dalton; 2 dapat menerima ukuran sampel yang relative besar; 3 memiliki interaksi yang minimal antara molekul yang
bermigrasi dengan matriks; 4 memiliki matriks yang fisiknya stabil. Elektroforesis melalui gel poliakrilamid dapat meningkatkan resolusi komponen sampel disebabkan oleh separasinya yang
berdasarkan penyaringan molekul dan mobilitas elektroforesis. Resolusi berat molekul yang dicapai melalui SDS-PAGE sebagian tergantung pada ukuran pori
dari gel polimer. Dengan demikian persentase akrilamid yang digunakan dalam preparasi gel perlu untuk diperhatikan. Persentase akrilamid yang digunakan akan tergantung pada kisaran berat molekul
sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan. Tabel 3 menunjukkan persentase akrilamid yang dapat
13
digunakan untuk fraksinasi protein yang memiliki kisaran berat molekul yang berbeda-beda Copeland, 1994.
Tabel 3. Persentase akrilamid yang digunakan untuk pemisahan molekul protein dengan kisaran
berat molekul tertentu.
Kisaran Berat Molekul Protein Persentase Akrilamid
200,000-60,000 120,000-30,000
75,000-18,000 60,000-15,000
45,000-12,000 5.0
7.5 10.0
12.5 15.0
Sumber : Copeland 1994
Menurut Copeland 1994, gel elektroforesis atau sistem buffer dapat berupa homogen continous atau multifase discontinuous. Sistem homogen mengandung ion buffer dan pH dalam
preparasi sampel, buffer elektorda, dan gel yang sama. Dalam sistem buffer multiphase, stacking gel yang berbeda komposisi pH danatau komposisi buffer, digunakan untuk mengkonsentrasi dan
menajamkan unsur pokok sampel sebelum masuk ke resolving gel separating gel. Buffer yang digunakan untuk menyiapkan dua lapisan gel tersebut memiliki pH dan kekuatan ion yang berbeda.
Stacking gel memiliki konsentrasi akrilamid yang lebih rendah, sehingga ukuran porinya jauh lebih besar.
Pembuatan separating gel dan stacking gel menggunakan buffer dan konsentrasi akrilamid yang berbeda. Pada separating gel atau resolving gel digunakan buffer dengan pH 8-9 dengan
konsentrasi akrilamid yang tinggi 7.5 yang membuatnya memiliki ukuran pori yang kecil, sedangkan pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.9 dengan konsentrasi akrilamid yang lebih
rendah 2-3 yang membuatnya memiliki ukuran pori yang besar. Dengan demikian, akan dihasilkan pembentukkan pita-pita sampel yang sangat baik pada stacking gel dan resolusi komponen sampel
yang terbentuk pada resolving gel juga sangat tinggi Boyer, 1993.