TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN

12 didenaturasikan. Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE dengan detergen anionik, sodium dodecyl sulfate SDS, digunakan untuk memisahkan subunit protein menurut ukurannya. Protein disolubilisasi dan dipisahkan menjadi subunit-subunit dalam suatu buffer yang mengandung SDS dan reducing agent. Reducing agent, seperti mercaptoethanol atau ditiotreitol, digunakan untuk mengurangi ikatan disulfida yang terdapat pada suatu subunit protein atau di antara subunit-subunit protein. Protein akan mengikat SDS, yang akan membuatnya menjadi bermuatan negatif, dan kemudian dipisahkan berdasarkan ukurannya sendiri Nielsen, 2010. SDS akan melapisi protein yang telah terdenaturasi. Pada bentuk terdenaturasi, kebanyakan protein mengikat SDS dalam rasio berat yang konstan, sehingga protein berakhir dengan memiliki densitas bermuatan yang sama. Di bawah kondisi seperti ini, tingkat migrasi protein dalam medan listrik tidak lagi tergantung pada muatan yang melekat pada molekul, tetap lebih ditentukan semata- mata oleh ukuran molekul sebagai contoh, protein yang lebih besar akan lebih sangat terhambat dalam migrasi dalam gel polimer dibandingkan dengan protein yang lebih kecil. Skema dari alat SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 4. Sampel protein akan diinjeksikan melalui sumur pada ujung atas gel yang kontak, melalui kolam buffer, dengan katoda. Bagian bawah gel juga terhubung dengan anoda. Ketika arus listrik diaplikasikan, protein yang terlapis oleh SDS akan bermigrasi ke bagian bawah gel, di bawah pengaruh medan listrik yang diberikan Copeland, 1994. Kompleks SDS-protein yang lebih besar akan memiliki mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks SDS- protein yang lebih kecil. Gambar 4 . Skema alat SDS-PAGE Jage, 2008 Menurut Boyer 1993, gel yang dibentuk dari polimerisasi akrilamid memiliki beberapa kelebihan positif dalam elektroforesis: 1 memiliki kemampuan pemisahan yang tinggi bagi protein dan asam nukleat yang berukuran kecil hingga sedang kira-kira hingga 1 × 10 6 dalton; 2 dapat menerima ukuran sampel yang relative besar; 3 memiliki interaksi yang minimal antara molekul yang bermigrasi dengan matriks; 4 memiliki matriks yang fisiknya stabil. Elektroforesis melalui gel poliakrilamid dapat meningkatkan resolusi komponen sampel disebabkan oleh separasinya yang berdasarkan penyaringan molekul dan mobilitas elektroforesis. Resolusi berat molekul yang dicapai melalui SDS-PAGE sebagian tergantung pada ukuran pori dari gel polimer. Dengan demikian persentase akrilamid yang digunakan dalam preparasi gel perlu untuk diperhatikan. Persentase akrilamid yang digunakan akan tergantung pada kisaran berat molekul sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan. Tabel 3 menunjukkan persentase akrilamid yang dapat 13 digunakan untuk fraksinasi protein yang memiliki kisaran berat molekul yang berbeda-beda Copeland, 1994. Tabel 3. Persentase akrilamid yang digunakan untuk pemisahan molekul protein dengan kisaran berat molekul tertentu. Kisaran Berat Molekul Protein Persentase Akrilamid 200,000-60,000 120,000-30,000 75,000-18,000 60,000-15,000 45,000-12,000 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Sumber : Copeland 1994 Menurut Copeland 1994, gel elektroforesis atau sistem buffer dapat berupa homogen continous atau multifase discontinuous. Sistem homogen mengandung ion buffer dan pH dalam preparasi sampel, buffer elektorda, dan gel yang sama. Dalam sistem buffer multiphase, stacking gel yang berbeda komposisi pH danatau komposisi buffer, digunakan untuk mengkonsentrasi dan menajamkan unsur pokok sampel sebelum masuk ke resolving gel separating gel. Buffer yang digunakan untuk menyiapkan dua lapisan gel tersebut memiliki pH dan kekuatan ion yang berbeda. Stacking gel memiliki konsentrasi akrilamid yang lebih rendah, sehingga ukuran porinya jauh lebih besar. Pembuatan separating gel dan stacking gel menggunakan buffer dan konsentrasi akrilamid yang berbeda. Pada separating gel atau resolving gel digunakan buffer dengan pH 8-9 dengan konsentrasi akrilamid yang tinggi 7.5 yang membuatnya memiliki ukuran pori yang kecil, sedangkan pada stacking gel digunakan buffer dengan pH 6.9 dengan konsentrasi akrilamid yang lebih rendah 2-3 yang membuatnya memiliki ukuran pori yang besar. Dengan demikian, akan dihasilkan pembentukkan pita-pita sampel yang sangat baik pada stacking gel dan resolusi komponen sampel yang terbentuk pada resolving gel juga sangat tinggi Boyer, 1993.

3.4 TEKSTUR

Tekstur adalah salah satu sifat yang sangat menentukan dalam produk pangan. Umumnya para produsen pangan menghasilkan produk dengan tekstur, flavor, dan penampakan yang sesuai dengan keinginan konsumen atau dapat diterima dengan baik oleh konsumen. Menurut deMan 1999, warna, flavor, dan tekstur merupakan atribut-atribut penting dalam kualitas pangan. Hal ini membuat pengetahuan mengenai penyebab terbentuknya tekstur tertentu menjadi sangat penting untuk diketahui oleh para pelaku industri pangan. Tekstur dipengaruhi oleh sifat fisik dan fisikokimia di antara produk-produk pangan. Bourne 2002 menyatakan bahwa perbedaan tekstur yang disukai diturunkan dari kompleksitas organ-organ pengunyahan manusia. Terdapat tiga tipe gigi yang berbeda, dan masing-masing memberikan fungsi yang berbeda-beda. Rahang dapat digerakkan dalam tiga tingkatan tergantung dari sifat alami makanan. Lidah memainkan peranan aktif dalam pengunyahan, dan untuk pangan lembut seperti es krim dan yogurt, lidah merupakan alat utama dalam membentuk bentuk makanan yang mampu 14 ditelan, di mana lidah hanya melakukan kerja yang sedikit. Saliva memainkan peranan utama dalam penyiapan makanan sebelum penelanan. Menurut deMan 1999, tekstur dapat didefinisikan sebagai cara di mana unsur pokok dan elemen-elemen struktur yang bermacam-macam disusun dan digabung ke dalam mikro- dan makrostruktur, dan manifestasi eksternal struktur ini berkenaan dengan aliran dan deformasi. Tekstur juga didefinisikan sebagai manifestasi sensori dari struktur pangan dan cara di mana struktur ini bereaksi untuk menerima gaya, indera spesifik termasuk penglihatan, kinestetik, dan pendengaran Szczesniak, 1990 yang dikutip oleh Bourne, 2002. Berdasarkan ISO tahun 1992 yang dikutip oleh Bourne 2002, tekstur adalah semua atribut mekanis permukaan dan geometris dari produk pangan yang dapat dijelaskan melalui alat mekanis, sentuhan, reseptor visual dan pendengaran. Szczesniak 1963 yang dikutip oleh Rosenthal 1999, karakteristik tekstur dapat dibagi ke dalam tiga kelas utama, yaitu: 1 karaktersitik mekanis, yaitu yang berhubungan dengan reaksi pangan terhadap tekanan, yang meliputi parameter primer kekerasan, kohesivitas, viskositas, elastisitas, daya adesif dan parameter sekunder daya kunyah, gumminess; 2 karakteristik geometris, yaitu yang berhubungan dengan ukuran, bentuk dan orientasi partikel dalam pangan —seperti, powdery, gritty, lumpy, flaky, fibrous, cellular, aerated, dan crystalline; 3 karakteristik lainnya —yaitu yang berhubungan dengan persepsi atas kadar air dan lemak dalam pangan seperti, kering, basah, dan berminyak. Menurut Scott-Blair 1958 yang dikutip oleh Rosenthal 1999, teknik instrumental untuk mengukur tekstur pangan dapat digolongkan menjadi tiga golongan, yaitu: 1 pengukuran empiris, yaitu metode untuk mengukur atribut mekanis produk dengan menggabungkan beberapa prinsip percobaan seperti penetrasi, pemotongan, penekanan, dan lain-lain; 2 pengukuran imitative, yaitu metode yang sengaja didesain dengan meniru proses pengunyahan dalam mulut manusia seperti Texture Profile Analysis TPA; 3 pengukuran fundamental, yaitu metode untuk mengukur atribut reologi atau fisik. Pengukuran imitatif dilakukan untuk meniru pengunyahan yang biasa terjadi dalam mulut manusia. Alat ini dibuat khusus untuk mengukur stress danatau strain selama rangkaian pengujian. Dulu pengujian seperti ini banyak sekali dilakukan, beberapa di antaranya menggunakan gigi-gigi manusia palsu yang saling bergerak, untuk meniru pergerakan dari rahang manusia. Sementara itu ada beberapa indra yang dibuat dengan alat yang memiliki geometri yang mirip dengan mulut manusia, untuk mendapatkan data yang sangat tergantung pada faktor-faktor seperti tipe dan posisi sensori serta gerakan rahang. Akan tetapi beberapa modifikasi kecil pada alat, seperti penggantian gigi-gigi palsu dengan plunger pada area cross-section, sehingga stress yang tepat dapat diaplikasikan, dan hal ini akan membuat alat menghasilkan data yang sangat berguna bagi aplikasi komparatif seperti quality assurance Rosenthal, 1999. Pengukuran imitatif yang dapat mewakili semua imajinasi dari banyak ahli teknologi pangan karena pengukurannya yang dapat menyediakan nilai tekstur pangan yang terstandarisasi adalah Texture Profile Analysis TPA, yang dalam General Foods di pertengahan tahun 1960. Dalam sebuah paper, Szczesniak 1963 dan koleganya menegaskan bermacam-macam istilah yang berhubungan dengan tekstur, yang dapat dilihat pada Tabel 4. Berdasarkan standar-standar sensori yang telah dibuat oleh Szczesniak dan koleganya, alat dengan gaya deformasi yang kompresif dikembangkan. Berdasarkan pada alat yang mendeformasi pangan melalui gerakan yang menyerupai rahang manusia, General Foods Texturometer menggunakan alat semacam plunger yang berujung pipih yang akan kontak langsung dengan sampel makanan guna mengukur tekstur pangan tersebut Friedman, Whitney, dan Szczesniak, 1963 yang dikutip oleh Rosenthal, 1999.