23
yang telah diinkubasi kemudian disentrifuse selama 20 menit pada suhu 25
o
C dengan kecepatan 15000 rpm. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung stok. Lebih lengkapnya dapat dilihat pada Gambar 8.
Supernatan
Supernatan
Supernatan
Gambar 8. Diagram alir ekstraksi protein modifikasi Mujoo et al. 2003
20 mg tahu bebas lemak Ditambah 500 µl larutan Tris
[Trishydroxymethylaminomethane] buffer pH 8.4 which contain 0.02 ε β-mercaptoethanol
Divorteks selama 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 1 jam vorteks tiap 10 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Ditambah 500 µl larutan Tris dan divorteks 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 1 jam vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Ditambah 500 µl larutan Tris dan divorteks 1 menit Diinkubasi pada penangas air suhu 80
o
C selama 40 menit vorteks tiap 20 menit selama 1 menit
Disentrifugasi 20 menit, 25
o
C, 15000 rpm Endapan
Larutan Stok
24
3.2.7 Analisis Kadar Protein Metode Bradford Bradford, 1976
a. Preparasi pereaksi Bradford
Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 ml etanol 95. Selanjutnya ditambahkan 100 ml asam fosforat 85 dan ditepatkan hingga 1 L dengan menggunakan
akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1 dan disimpan dalam botol gelap.
b. Pembentukan kurva standar
Sebanyak 100 µl larutan BSA 100-1000 µgml dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Tabung reaksi lalu ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian
divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada = 5λ5 nm setelah 5 menit. Pembuatan blanko dilakukan dengan cara yang sama, hanya saja larutan BSA diganti dengan akuades. Sebanyak 100
ul akuades ditambahkan 5 ml perekasi Bradford dan diukur dengan cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel.
c. Pengukuran sampel
Sebanyak 100 ul sampel dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford. Larutan kemudian divorteks dan diukur secara
spektrofotometri pada = 5λ5 nm setelah 5 menit.
3.2.8 Analisis SDS- Polyacrylamide Gel Electrophoresis Bollag dan Edelstein,
1991
Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12 dan stacking gel 5. Sampel yang dielektroforesis merupakan supernatan protein hasil ekstraksi
protein dari sampel tahu. Tahapan yang dilakukan dalam analisis SDS-PAGE adalah 1 pembuatan separating gel; 2 pembuatan stacking gel; 3 preparasi dan injeksi sampel; 4 running SDS-PAGE;
5 pewarnaan gel; 6 destaining gel; dan 7 penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 1.
a. Pembuatan separating gel
Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet ke dalam gelas piala,
kemudian ditambahkan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat. Campuran tersebut kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl
APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab dengan menggunakan
mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan dan diusahakan agar tidak terdapat gelembung udara pada lempengan kaca tersebut. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades
untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30 - 60 menit.
b. Pembuatan stacking gel
Air akuades dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tisu. Akua-biodestilat, larutan A, dan larutan C masing-masing sebanyak 2.3 ml, 0.67 ml, dan 1.0 ml
dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10 dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan
25
diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan
mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis
dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. c.
Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl
buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100
o
C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas
menggunakan akuades setiap kali ingin memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 µl protein marker.
d. Running SDS-PAGE
Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa
sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda.
e. Pewarnaan gel
Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomassie brilliant blue kurang lebih 20 ml. Wadah tertutup tersebut kemudian
digoyang-goyangkan sesekali selama 5-10 menit. f.
Destaining gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna
ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis.
g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan
Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker penanda protein dan logaritma dari berat molekul marker yang telah
diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye.
Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai: Rf =
Jarak migrasi protein Jarak migrasi tracking dye
3.2.9 Analisis Densitas Pita Protein
Gel yang didapat dari tahap SDS-PAGE, kemudian didokumentasikan dalam bentuk gambar digital menggunakan alat Gel Doc Bio-Rad. Densitas pita protein yang terlihat dalam gel tersebut
kemudian dianalisis menggunakan perangkat lunak ImageJ 1.42q dari Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA http:rsb.info.nih.govij. Melalui perangkat lunak ini, pita protein yang
terdapat pada gel elektroforesis dikonversi menjadi grafik. Luas area di bawah grafik merupakan densitas pita protein. Gambar 9 menunjukkan contoh hasil berupa grafik yang didapatkan dari ImageJ
1.42q. Penentuan luas wilayah di bawah grafik juga ditentukan dengan menggunakan software ImageJ 1.42q ini. Rasio luas masing-masing wilayah di bawah grafik terhadap total luas wilayah satu sampel
dikalikan dengan seratus persen adalah persentase dari subunit protein atau polipeptida. Persentase ini merupakan nilai komposisi subunit atau polipeptida suatu sampel.
