9
Tabel 1. Beberapa golongan bahan penggumpal tahu yang umum digunakan
Golongan Jenis yang umum digunakan
Garam klorida nigari Garam sulfat
Lakton Asam
nigari alami, MgCl
2
.6H
2
O, air laut, CaCl
2
, CaCl
2
.2H
2
O CaSO
4
.2H
2
O dan MgSO
4
.7H
2
O C
6
H
10
O
6
glukono- -laktonGDL Asam laktat, sari buah jeruk, asam asetat,
cuka larutan asam asetat 4
Sumber : Shurtleff dan Aoyogi 1984
Tabel 2. Jenis koagulan yang biasa dipakai untuk beberapa tipe tahu beserta suhu koagulasinya
Tipe Tahu Koagulan
Suhu Koagulasi
Regular atau Firm Tipe Nigari
1
Kalsium sulfat Lakton GDL
Sari lemon Vinegar
70-85
o
C 70-75
o
C 90
o
C 80-90
o
C 80-90
o
C Tahu Silken
Tipe Nigari Kalsium sulfat
65-68
o
C 70
o
C Tahu silken dalam bungkus
Lakton Kalsium sulfat
85
o
C
2
90
o
C
2
Keterangan : 1 Termasuk nigari alami, magnesium klorida dan kalsium klorida. 2 Koagulan ditambahkan pada susu kedelai dingin kemudian dipanaskan hingga 85
o
C atau 90
o
C. Sumber :
Shurtleff dan Aoyogi 2001
Nigari alami atau juga dikenal dengan ―bittern‖, diekstrak dari air laut dengan menghilangkan
hampir atau semua garam meja NaCl dan air. Campuran mineral laut alami mengandung utamanya magnesium klorida dan semua garam lain dan sisa-sisa mineral dalam air laut. Koagulan tipe nigari
mampu menghasilkan tahu yang paling enak, mengingat aroma dan flavor manisnya yang sangat halus. Nigari dibandingkan dengan kalsium sulfat dan lakton memiliki kekurangan, yaitu nigari harus
ditambahkan perlahan, beberapa kali ke dalam susu kedelai. Penggumpalan menggunakan nigari membutuhkan waktu yang lama. Selain itu dibutuhkan kemampuan dan pengetahuan dalam
menggunakan koagulan ini. Kekurangan lainnya adalah tahu yang dihasilkan tidaklah terlalu lembut dan halus Shurtleff dan Aoyogi, 2001.
Koagulan tipe sulfat merupakan koagulan yang sudah digunakan secara luas di dunia. Jenis yang paling umum adalah kalsium sulfat garam gypsum dan magnesium sulfat garam Epsom.
Koagulan-koagulan ini sangat tepat bagi metode produksi masal modern walaupun koagulan ini terdispersi dengan lambat dalam air untuk membentuk larutan koloid yang memiliki waktu reaksi
koagulasi yang lambat. Namun penggunaan koagulan ini cukup mudah, bahkan bagi orang yang tidak terlatih Shurtleff dan Aoyogi, 2001. Selain itu menurut Obatolu 2007 semakin lambat aksi
pengkoagulasian oleh koagulan, semakin baik rendemen tahu yang dihasilkan dibandingkan dengan koagulan yang cepat aksi pengkoagulasiannya.
10
Koagulan tipe lakton atau GDL, merupakan koagulan nomor dua yang digunakan secara luas sebagai koagulan tahu di Jepang. Hasil dari pengkoagulasian protein menggunakan koagulan ini
adalah tahu sutra silken tofu. Ketika lakton dicampurkan dengan susu kedelai dan dipanaskan, lakton akan memproduksi asam glukonat yang mengkoagulasi protein susu kedelai untuk membentuk tahu
sutra, dan proses ini hampir mirip dengan proses yang terjadi pada asam, yang diproduksi oleh mikroba starter, yang digunakan pada saat pembuatan yogurt Shurtleff dan Aoyogi, 2001.
Mekanisme gelasi protein oleh koagulan CaSO
4
dan GDL dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Mekanisme gelasi protein oleh koagulan CaSO
4
dan GDL. Kohyama et al., 1995 Koagulan tipe asam yang sering digunakan dalam pengendapan protein kedelai adalah asam
laktat seperti yang dihasilkan secara alami oleh Lactobacillus. Asam laktat memberikan flavor yang jauh lebih baik dibandingkan dengan lakton dan menghasilkan struktur molekul yang lebih kecil juga.
Asam asetat bahkan memberikan performa yang lebih baik dibandingkan dengan asam laktat, karena dapat mengkoagulasikan protein sebanyak 67.8 dari total protein, ketika pH diturunkan menjadi 4.5,
di mana asam laktat hanya mampu mengkoagulasikan 55 dari total protein kedelai. Asam lainnya yang aman untuk pangan seperti asam sulfurat, hidroklorat, fosforat, sitrat, malat atau tartarat dapat
juga digunakan secara komersial dalam pengendapan curd konsentrat protein kedelai Shurtleff dan Aoyogi, 2001.
Berbagai sari buah jeruk khususnya sari lemon dapat bekerja sama baiknya dengan koagulan alami, dan koagulan ini mungkin merupakan yang terbaik bagi Negara tropis di mana harganya tidak
terlalu mahal dan tersedia secara local, walaupun dibandingkan dengan nigari dan kalsium sulfat rendemen tahunya lebih rendah, tekstur sedikit rapuh, dan flavornya sedikit asam. Di Indonesia whey
tahu yang telah dibiarkan terfermentasi selama semalam diinokulasikan dengan sedikit whey terfermentasi dari hari sebelumnya hingga menjadi asam juga dapat digunakan sebagai koagulan
yang gratis dan mudah dibuat lagi dan juga mampu menghasilkan tahu dengan mutu yang bagus. Di Thailand dan Burma, sari buah beri yang pahit dari pohon tertentu dikatakan dapat digunakan juga
sebagai koagulan Shurtleff dan Aoyogi, 2001.
Struktur awal Protein
Protein terdenaturasi
Pemanasan Tahap Pertama
Tahap Kedua Agregasi
Struktur Jaringan
Gel
Gel
11
3.3 TEKNIK ELEKTROFORESIS DALAM ANALISIS PROTEIN
Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu zat melalui migrasi partikel bermuatan atau ion-ion makromolekul di bawah pengaruh medan listrik. Menurut Nielsen
2010 elektroforesis adalah migrasi molekul bermuatan dalam suatu larutan melalui suatu medan listrik. Migrasi partikel ini tergantung dengan viskositas larutan, ukuran dan muatan partikel, dan yang
paling penting adalah voltase yang digunakan Pomeranz dan Meloan, 1994. Selain itu Rybicky dan Purves 1996 juga menyatakan bahwa tingkat migrasi partikel bermuatan tergantung dari kekuatan
medan, muatan total, ukuran, bentuk dan kekuatan ion partikel, viskositas, dan suhu medium di mana molekul bergerak.
Menurut Copeland 1994, metode elektroforesis telah digunakan secara luas dalam penganalisisan protein untuk mencari tingkat kemurnian, berat molekul, dan terkadang titik
isoelektrik. Teknik elektroforesis juga sering digunakan untuk mengetahui komposisi produk pangan. Sebagai contoh, perbedaan dalam komposisi protein dari konsentrat protein kedelai dan konsentrat
protein whey yang dihasilkan melalui teknik separasi yang berbeda, dapat dideteksi Nielsen, 2010. Banyak molekul biologis, seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam nukleat,
yang memiliki grup yang dapat berionisasi pada pH berapapun yang digunakan, yang terdapat dalam larutan baik sebagai kation + maupun anion -. Di bawah pengaruh medan listrik, partikel
bermuatan ini akan bermigrasi baik ke katoda maupun ke anoda, tergantung dengan muatan alaminya Wilson dan Walker, 2000. Menurut Nielsen 2010, besarnya muatan dan voltase yang digunakan
akan menentukan berapa jauh sebuah protein akan bermigrasi dalam suatu medan listrik. Namun terdapat juga gaya gesek yang menghambat pergerakan dari molekul bermuatan ini. Gaya gesek ini
ditimbulkan oleh ukuran hidrodinamik dari molekul, bentuk molekul, ukuran pori-pori medium di mana elektroforesis dilakukan, dan viskositas dari buffer Wilson dan Walker, 2000.
Tipe elektroforesis yang paling umum dilakukan untuk protein adalah elektroforesis zonal, di mana protein dipisahkan dari campuran yang kompleks menjadi pita-pita melalui migrasi dalam buffer
encer dalam matriks polimer padat yang disebut gel. Gel poliakrilamid adalah matriks yang paling umum digunakan untuk elektroforesis protein, walaupun matriks-matriks lainnya seperti pati dan
agarosa mungkin digunakan. Matriks gel dibentuk sebagai slab diantara dua papan gelas Nielsen, 2010.
Matriks gel poliakrilamid dibentuk melalui polimerisasi akrilamid dan sejumlah kecil biasanya 5 atau kurang dari cross-linking reagent,
N, N‘-metilenbisakrilamid, dengan kehadiran katalis, tetrametiletilendiamin TEMED, dan sebuah sumber radikal bebas, amonium persulfat Nielsen,
2010. Mekanisme pembentukan gel adalah polimerisasi adisi vinil dan dikatalis oleh sistem radikal bebas yang terbentuk dari ammonium persulfat inisiator dan TEMED katalis. TEMED
menyebabkan pembentukkan radikal bebas dari persulfat dan berturut-turut mengkatalisis polimerisasi. Oksigen, pengikat radikal,dapat mengganggu polimerisasi, sehingga penghilangan gas
yang tepat untuk menghilangkan oksigen terlarut dari larutan akrilamid sangatlah penting bagi pembentukan gel. Setelah akrilamid aktif terbentuk, akrilamid aktif akan bereaksi dengan akrilamid
lain untuk membentuk rantai polimer panjang. Gel kemudian terbentuk sebagai hasil dari polimerisasi ini dengan struktur berbentuk jala. Jumlah akrilamid dan ikatan silang dari akrilamid yang digunakan
akan menentukan ukuran pori serta ukuran jala dari gel Garfin, 1990. Pemisahan protein dapat dilakukan dengan cara elektroforesis native, yaitu protein dipisahkan
menurut bentuk alaminya berdasarkan muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Namun pemisahan protein yang biasanya digunakan adalah melalui elektroforesis denaturasi. Teknik ini dilakukan
dengan menggunakan media poliakrilamid dan protein yang akan dipisahkan terlebih dahulu
12
didenaturasikan. Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE dengan detergen anionik, sodium dodecyl sulfate SDS, digunakan untuk memisahkan subunit protein menurut ukurannya. Protein
disolubilisasi dan dipisahkan menjadi subunit-subunit dalam suatu buffer yang mengandung SDS dan reducing agent. Reducing agent, seperti mercaptoethanol atau ditiotreitol, digunakan untuk
mengurangi ikatan disulfida yang terdapat pada suatu subunit protein atau di antara subunit-subunit protein. Protein akan mengikat SDS, yang akan membuatnya menjadi bermuatan negatif, dan
kemudian dipisahkan berdasarkan ukurannya sendiri Nielsen, 2010. SDS akan melapisi protein yang telah terdenaturasi. Pada bentuk terdenaturasi, kebanyakan
protein mengikat SDS dalam rasio berat yang konstan, sehingga protein berakhir dengan memiliki densitas bermuatan yang sama. Di bawah kondisi seperti ini, tingkat migrasi protein dalam medan
listrik tidak lagi tergantung pada muatan yang melekat pada molekul, tetap lebih ditentukan semata- mata oleh ukuran molekul sebagai contoh, protein yang lebih besar akan lebih sangat terhambat
dalam migrasi dalam gel polimer dibandingkan dengan protein yang lebih kecil. Skema dari alat SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 4. Sampel protein akan diinjeksikan melalui sumur pada ujung
atas gel yang kontak, melalui kolam buffer, dengan katoda. Bagian bawah gel juga terhubung dengan anoda. Ketika arus listrik diaplikasikan, protein yang terlapis oleh SDS akan bermigrasi ke bagian
bawah gel, di bawah pengaruh medan listrik yang diberikan Copeland, 1994. Kompleks SDS-protein yang lebih besar akan memiliki mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks SDS-
protein yang lebih kecil.
Gambar 4 . Skema alat SDS-PAGE Jage, 2008
Menurut Boyer 1993, gel yang dibentuk dari polimerisasi akrilamid memiliki beberapa kelebihan positif dalam elektroforesis: 1 memiliki kemampuan pemisahan yang tinggi bagi protein
dan asam nukleat yang berukuran kecil hingga sedang kira-kira hingga 1 × 10
6
dalton; 2 dapat menerima ukuran sampel yang relative besar; 3 memiliki interaksi yang minimal antara molekul yang
bermigrasi dengan matriks; 4 memiliki matriks yang fisiknya stabil. Elektroforesis melalui gel poliakrilamid dapat meningkatkan resolusi komponen sampel disebabkan oleh separasinya yang
berdasarkan penyaringan molekul dan mobilitas elektroforesis. Resolusi berat molekul yang dicapai melalui SDS-PAGE sebagian tergantung pada ukuran pori
dari gel polimer. Dengan demikian persentase akrilamid yang digunakan dalam preparasi gel perlu untuk diperhatikan. Persentase akrilamid yang digunakan akan tergantung pada kisaran berat molekul
sesuai dengan sampel yang akan dipisahkan. Tabel 3 menunjukkan persentase akrilamid yang dapat
