Uji per oral Pada uji per oral, hewan dibagi dalam 5 kelompok yaitu: Uji topikal Uji Efek Analgetik Analisis Data

sesuai. Hewan dibagi dalam 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 6 hewan uji untuk dilakukan uji antiinflamasi dan analgetik.

a. Uji per oral Pada uji per oral, hewan dibagi dalam 5 kelompok yaitu:

i. Kelompok I sebagai pembanding negatif diberikan suspensi CMC 0,5 dengan dosis 1 BB. ii. Kelompok II sebagai pembanding positif diberikan suspensi indometasin 10 mgkg BB untuk uji antiinflamasi dan suspensi antalgin 2 dengan dosis 100 mgkgBB untuk uji analgetik. iii. Kelompok III-IV-V sebagai hewan uji masing-masing diberikan suspensi EEM, En-HM, dan EEAcM dengan dosis 500, 600, dan 700 mgkgBB.

b. Uji topikal

Pada uji topikal, hewan dibagi dalam 5 kelompok yaitu: i. Kelompok I sebagai pembanding negatif diberikan suspensi CMC 0,5 dengan dosis 1 BB. ii. Kelompok II sebagai pembanding positif diberikan sediaan gel natrium diklofenak 1, untuk uji antiinflamasi. iii. Kelompok III-V sebagai hewan uji diberikan gel EEM dengan konsentrasi masing-masing 1, 3, dan 6.

3.7 Sampel Penelitian

3.7.1 Pengambilan dan Pengolahan Sampel

Sampel penelitian yang digunakan adalah daun mondokaki yang diperoleh secara purposif dari Kecamatan Deli Tua, Kabupaten Deli Serdang, Provinsi Universitas Sumatera Utara Sumatera Utara. Gambar tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 138. Bagian tanaman yang digunakan adalah daun. Tanaman dibersihkan dan dibilas dalam air mengalir sebanyak 2 kali. Daun dikeringkan dengan cara mengeringkan di dalam oven. Daun digiling dengan alat penggiling sampai halus dan dilakukan skrining fitokimia, uji kadar air, dan diekstraksi dengan pelarut etanol, n-heksan dan etil asetat.

3.7.2 Uji Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, pendingin, tabung penyambung dan pemanas. Gambar alat penetapan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 5, Gambar 3.4., halaman 140. Cara penetapan kadar air: Toluena sebanyak 200 ml dan air suling 2 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Toluena didinginkan selama 30 menit dan volume air ditampung pada tabung penerima lalu dibaca. Kemudian ke dalam labu dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur ±2 tetes tiap detik, hingga sebagian besar air tersuling. Kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Universitas Sumatera Utara Selisih kedua volume air dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.

3.7.3 Ekstraksi Simplisia Daun Mondokaki

Serbuk simplisia sebanyak 400 g, masing-masing dimasukkan ke dalam 3 buah bejana bertutup dan dibasahi dengan sejumlah cairan penyari etanol 96, n-heksan dan etil asetat kemudian dimaserasi selama 3 jam. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, kemudian cairan penyari dituangkan secukupnya dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml tiap menit, cairan penyari ditambahkan berulang-ulang sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia, perkolasi dihentikan sampai perkolat terakhir yang keluar telah jernih. Perkolat diuapkan dengan menggunakan alat penguap vakum putar rotary evaporator. Kemudian dikeringkan dengan freeze driyer selama lebih kurang 24 jam dan diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh selanjutnya disebut ekstrak etanol mondokaki EEM, ekstrak n-heksan mondokaki En-HM dan ekstrak etil asetat mondokaki EEAcM Depkes RI, 1974.

3.8 Uji Farmakologi

Uji farmakologi yang dilakukan adalah uji antiinflamasi dan uji analgetik. Uji ini dilakukan secara oral untuk masing-masing ekstrak etanol mondokaki, ekstrak n-heksan, dan ekstrak etil asetat. Dari ketiga ekstrak ini, mana yang Universitas Sumatera Utara memiliki efek antiinflamasi terkuat dibuat dalam bentuk gel dan kemudian secara topikal diuji efek antiinflamasinya.

3.8.1 Uji Efek Antiinflamasi

Pengujian efek antiinflamasi terdiri dari beberapa tahap antara lain penyiapan hewan uji, penyiapan bahan uji, kontrol, pembanding, penginduksi radang dan pengujian efek antiinflamasi secara oral dan topikal. 3.8.1.1 Penyiapan Hewan Percobaan Hewan percobaan dipelihara pada kandang dengan memiliki ventilasi yang baik dan selalu dijaga kebersihannya. Hewan yang sehat ditandai dengan kenaikan berat badan yang teratur dan memperlihatkan gerakan yang lincah. Setiap kali perlakuan selesai, mencit diistirahatkan, selanjutnya mencit dapat digunakan kembali untuk perlakuan berikutnya Wirda, 2001. Gambar hewan percobaan dapat dilihat pada Lampiran 7, Gambar 3.5., halaman 142. 3.8.1.2 Penyiapan Bahan Uji, Obat Pembanding dan Kontrol EEM, En-HM, dan EEAcM dan obat pembanding yaitu indometasin dibuat dalam bentuk suspensi dengan CMC 0,5. Sebagai kontrol adalah suspensi CMC 0,5. 3.8.1.3 Pembuatan Suspensi CMC 0,5 bv Ke dalam lumpang hangat masukkan air suling panas sebanyak 20 ml, kemudian taburkan 500 mg CMC, lumpang ditutup dan dibiarkan selama 30 menit hingga diperoleh masa transparan, kemudian gerus dan masukkan dalam labu ukur 100 ml, kemudian dicukupkan dengan air suling sampai 100 ml. Universitas Sumatera Utara

3.8.1.4 Pembuatan SEEM, SEn-HM, dan SEEAcM 1 bv

Masing-masing EEM, En-HM, dan EEAcM sebanyak 250 mg dimasukkan ke dalam lumpang yang berisi sedikit suspensi CMC 0,5, digerus sampai homogen, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 250 ml, lalu dicukupkan dengan CMC 0,5 hingga 10 ml. 3.8.1.5 Pembuatan Suspensi Indometasin Dosis 10 mgkg BB Sebanyak 50 mg indometasin digerus, kemudian ditambahkan suspensi CMC 0,5 sedikit demi sedikit sambil digerus hingga homogen, lalu dimasukkan kedalam labu ukur 50 ml, lalu dicukupkan hingga 50 ml.

3.8.1.6 Penyiapan Induktor Inflamasi

Sebanyak 0,1 gram karagenan dilarutkan dalam larutan NaCl 0,9 dalam labu ukur 10 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o

3.8.1.7 Persiapan Alat Pletismometer UGO Basile Cat. No. 7140

C selama 24 jam. Alat yang digunakan untuk uji antiinflamasi adalah pletismometer digital UGO Basile Cat.No 7140 dapat dilihat pada Gambar 3.8. lampiran 8, halaman

143. Penyiapan Larutan:

Larutan pengukur untuk alat Pletismometer digital dibuat dengan cara mencampurkan 2 ml larutan Ornamo Imbibente dengan 0,4 gram NaCl dalam labu ukur 1 liter, kemudian ditambahkan dengan air suling hingga 1 liter dan dihomogenkan. Persiapan Alat: Penampung reservoir pletismometer diisi dengan larutan pengukur. Katup tabung dibuka sampai tabung terisi dengan larutan pengukur hingga garis Universitas Sumatera Utara tanda berwarna merah. Pletismometer dihidupkan dan dikondisikan selama 15 menit, alat dikalibrasi sebelum digunakan.

3.8.1.8 Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan dilakukan dengan menguji beberapa dosis dari masing- masing ekstrak mondokaki terhadap hewan uji.

3.8.1.9 Uji Efek Antiinflamasi per Oral

Langkah-langkah pengujian: a. sebelum dilakukan pengujian, mencit dipuasakan selama 18 jam dan air minum tetap diberikan. b. pada hari pengujian, masing-masing hewan ditimbang dan dihitung dosisnya. Hewan yang akan diuji dikelompokkan menjadi 5 kelompok. Kelompok 1: diberi suspensi CMC 0,5 Kelompok 2: diberi suspensi indometasin dosis 10 mgkg BB Kelompok 3: diberi suspensi ekstrak mondokaki dosis 500 mgkg BB Kelompok 4: diberi suspensi ekstrak mondokaki dosis 600 mgkg BB Kelompok 5: diberi suspensi ekstrak mondokaki dosis 700 mgkg BB d. pada sendi kaki kiri sebagai batas pengukuran volume kaki mencit diberi tanda agar pemasukan kaki ke dalam air raksa setiap kali selalu sama. Volume kaki mencit diukur dan dinyatakan sebagai volume dasar Vo yaitu volume kaki sebelum diberi obat dan diinduksi dengan karagenan. Kemudian masing-masing mencit diberikan suspensi ekstrak, indometasin, dan CMC 0,5. Untuk setiap mencit pada setiap kali pengukuran volume diperiksa tinggi cairan pada alat dan dicatat sebelum dan sesudah pengukuran. Universitas Sumatera Utara d. setengah jam kemudian telapak kaki disuntikkan secara intraplantar 0,05 ml karagenan 1, diukur pada alat dan dicatat. Pengukuran yang sama dilakukan setiap setengah jam, dicatat perbedaan volume kaki selama 6 jam. e. perubahan volume air raksa dicatat sebagai volume telapak kaki mencit. f. perhitungan persentase kenaikan volume kaki dilakukan dengan membandingkannya terhadap volume dasar sebelum penyuntikan karagenan. g. untuk setiap kelompok dihitung persentase rata-rata dan dibandingkan dari persentase yang diperoleh pada kelompok yang diberi obat terhadap kelompok kontrol pada jam yang sama.

3.8.1.10 Uji Antiinflamasi Topikal

Langkah-langkah pengujian: a. pada hari pengujian masing-masing hewan disiapkan b. pada sendi kaki diberi tanda sebagai batas pengukuran volume kaki mencit dan diukur volumenya sebagai volume awal Vo yaitu volume kaki sebelum diberi obat dan diinduksi dengan larutan karagenan c. kemudian masing-masing mencit diinduksikan dengan lamda karagenan 1 sebanyak 0,05 ml Jeanne, 2006 secara intraplantar untuk menginduksi inflamasi pada telapak kaki mencit d. satu jam kemudian masing-masing telapak kaki mencit diberi obat secara topikal. Pemberian dilakukan dengan kain kasa lalu dibalut hingga telapak Universitas Sumatera Utara kaki tertutup seluruhnya. Sebagai pengikat digunakan plaster sehingga kasa tidak mudah terlepas e. pengukuran dilakukan setiap selang waktu 30 menit selama 6 jam dan masing-masing mencit hanya dilakukan sekali pengukuran sesuai dengan waktu untuk setiap mencit. Pengukuran dilakukan dengan cara mencelupkan kaki mencit ke dalam alat sampai batas tanda lalu ditekan pedal hold. f. perubahan volume pada layar dicatat sebagai volume waktu tertentu V t telapak kaki mencit. Volume inflamasi adalah selisih volume telapak kaki mencit setelah V t dan sebelum Vo disuntik karagenan. Pada waktu pengukuran, volume air raksa harus sama setiap kali pengukuran, tanda batas pada kaki mencit harus jelas, kaki mencit harus tercelup sampai batas yang sudah ditentukan.

3.8.1.11 Perhitungan Persen Radang R dan Inhibisi Radang IR

Rumus perhitungan persen radang R dan persen inhibisi radang IR menurut Rosidah 2001 adalah: Rumus perhitungan persen radang R adalah: Persen inflamasi = x Vo Vo Vt 100 − dimana : Vt = Volume inflamasi setelah waktu t Vo = Volume awal kaki mencit Rumus perhitungan persen inhibisi radang IR adalah: Persen Inhibisi Inflamasi = x a b a 100 − Universitas Sumatera Utara dimana : a = persen rata-rata inflamasi kelompok kontrol b = persen rata-rata inflamasi kelompok perlakuan yang mendapat bahan uji atau obat pembanding

3.9 Uji Efek Analgetik

Uji efek analgetik dilakukan dengan menggunakan pelat panas Rahman, 2005. a. mencit dipuasakan selama 18 jam, dan dikondisikan selama 24 jam pada kotak pengamatan alat b. pada hari percobaan ditimbang mencit dan diberi obat per oral dengan beberapa dosis yang telah ditentukan c. alat dipasang dan dihidupkan, panas pelat sampai mencapai temperatur 45 o d. pengamatan dilakukan dengan melihat pertama kali mencit menjilat telapak kaki, kemudian waktu dicatat dari pertama kali mencit diletakkan pada pelat sampai mengangkat dan menjilat kaki, selang waktu 10, 20, 30, 45, 60, 90 dan 120 menit, perbedaan waktu daya tahan mencit dicatat dan dihitung. Gambar alat pelat panas terdapat pada Lampiran 8, halaman 143. C, lalu mencit diletakkan pada pelat panas

3.10 Analisis Data

Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap. Dalam rancangan acak lengkap, data sampel disusun seperti ditunjukkan Tabel 3.1 dan uji statistik menggunakan Anava Tabel 3.2. Universitas Sumatera Utara Tabel 3.1. Rancangan Acak Lengkap A. Ekstrak Etanol Perlakuan t Ulangan r Jumlah T Rataan W W 1 W 2 W 3 W n SCMC 0,5 EEM 1 EEM SI 0,5 n R R 1 R 2 R 3 R n R R 1 R 2 R 3 R R n R 1 R 2 R 3 R n R R 1 R 2 R 3 R ΣRSCMC n ΣR ΣR 1 ΣR n SCMC0,5 obat pembanding EEM 1 EEM SI 0,5 n Jumlah ΣW Σ W 1 Σ W 2 ΣW 3 ΣW T n y ij ij EEM = Ekstrak Etanol Mondokaki SI = Suspensi Indometasin SCMC = Suspensi CMC B. Ekstrak n-Heksan Perlakuan t Ulangan r Jumlah T Rataan W W 1 W 2 W 3 W n SCMC 0,5 EHM 1 EHM SI 0,5 n R R 1 R 2 R 3 R R n R 1 R 2 R 3 R R n R 1 R 2 R 3 R R n R 1 R 2 R 3 R ΣRSCMC n ΣR ΣR 1 ΣRSI n SCMCl EHM 1 EHM SI 0,5 n Jumlah ΣW Σ W 1 Σ W 2 ΣW 3 ΣW T n y ij ij EHM = Ekstrak n-Heksan Mondokaki SI = Suspensi Indometasin SCMC = Suspensi CMC Universitas Sumatera Utara

c. Ekstrak Etil Asetat