BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas MIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan. Waktu penelitian dimulai bulan Juni hingga
bulan Desember 2013.
3.2 Bahan dan Alat
Eksplan yang dipakai adalah dari bagian apikal bud kelapa sawit Elaeis guineensis Jacq. Var. Tenera yang berumur 8 bulan. Bibit kelapa sawit berasal
dari hasil zigotik di PPKS MARIHAT. Bahan kimia yang digunakan adalah komponen penyusun media Eeuwens Y3 , zat pengatur tumbuh 2,4
Dichlorophenoxyacetic acid 2,4-D. Larutan HCl 0,1 N dan NaOH 0,1 N digunakan untuk mendapatkan pH 6. Untuk sterilisasi digunakan alkohol 70,
Fungisida, Tween 20, Betadine, larutan Natrium hipoklorit 1,0 dan 0,5. Peralatan yang digunakan adalah autoklaf, laminar air flow,cawan petri, lampu
spiritus, gelas piala, pipet, pinset, tangkai skalpel dan pisau skalpel untuk keperluan penanaman eksplan ke media.
3.3 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 2 faktorial, yaitu:
Faktor 1 :
Penambahan ZPT 2,4-D A
1
: Konsentrasi 110 mgL A
2
: Konsentrasi 120 mgL A
3
: Konsentrasi 130 mgL
Faktor 2 :
Posisi Sumber Eksplan A : Apeks
M : Median B : Basal
Sehingga diperoleh kombinasi 9 perlakuan untuk masing-masing kelompok percobaan dengan masing-masing ulangan sebanyak 8 kali Tabel 3.1. Rincian
kombinasi perlakuan sebagai berikut: A
1
A A
1
M A
1
B A
2
A A
2
M A
2
B A
3
A A
3
M A
3
B
Tabel 3.1. Rancangan Plot Perlakuan Posisi Eksplan dengan Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh.
2,4 D Posisi
Ulangan Konsentrasi Eksplan
1 2
3 4
5 6
7 8
110 mgL A
A
1
A A
1
A A
1
A A
1
A A
1
A A
1
A A A
A1A M
A
1
M A
1
M A
1
M A
1
M A
1
M A
1
M A1M A1M B
A
1
B A
1
B A
1
B A
1
B A
1
B A
1
B A1B A1B
120 mgL A
A
2
A A
2
A A
2
A A
2
A A
2
A A
2
A A2A A2A M
A
2
M A
2
M A
2
M A
2
M A
2
M A
2
M A2M A2M B
A
2
B A
2
B A
2
B A
2
B A
2
B A
2
B A2B A2B
130 mgL A
A
3
A A
3
A A
3
A A
3
A A
3
A A
3
A A3A A3A M
A
3
M A
3
M A
3
M A
3
M A
3
M A
3
M A3M A3M B
A
3
B A
3
B A
3
B A
3
B A
3
B A
3
A A3B A3B
3.4 Prosedur Kerja
Material tanaman apikal bud diambil dari bibit kelapa sawit dengan menggunakan pisau . Pada saat pengambilan sumber eksplan. Dilakukan pada
beberapa titik pertumbuhan dan diberi angka pemetaan yaitu 1 apikal bud ujung Apex, 2 apikal bud tengah middle, dan 3 apikal bud pangkal Basal dengan
jumlah ulangan 8. Ukuran eksplan 1-2 cm.
3.4.1 Pembuatan media
Media yang digunakan adalah media Eeuwens Y3, dimana masing- masing unsur hara makro, mikro, vitamin dan zat pengatur tumbuh komposisi
lengkap media Eeuwens Y3 dapat dilihat pada Lampiran 2. Semua larutan stok media yang akan dibuat dimasukkan kedalam labu takar, dilarutkan dengan
penambahan aquadest sebanyak 1 L, dan diberi penambahan zat pengatur tumbuh, selanjutnya penambahan 30 gL gula. Setelah semua unsur-unsur larut kemudian
dikalibrasi pada pH 6 dipanaskan sampai hampir mendidih selanjutnya diberi penambahan bacto agar sebanyak 7 gL aduk larutan selama 2-3 menit sampai
medium tampak bening, setelah itu diberi penambahan arang aktif sebanyak 2 gL aduk larutan hingga merata, tahap berikutnya larutan dimasukkan kedalam botol
kultur masing-masing sebanyak 10 ml, selanjutnya media disterilisasi menggunakan autoklaf 121
C selama 15 menit. Setelah suhu media sama dengan suhu kamar maka simpanlah media didalam ruangan stok. Pembuatan media
dilakukan satu minggu sebelum penanaman eksplan. Eewuen, 1976
3.4.2 Sterilisasi Eksplan
Sterilisasi eksplan menggunakan metode Zulkarnain 2009 yang dimodifikasi. Eksplan berupa apical bud kelapa sawit dibersihkan dengan air
mengalir dan direndam dalam detergen selama + 10 menit, kemudian dibilas dengan akuades steril hingga bersih. Eksplan dishaker dalam larutan fungisida
0,2 yang diberi 200 µL tween 80
®
selama 30 menit. Selanjutnya dibilas dengan akuades steril. Eksplan direndam dalam larutan antibiotik Betadine
®
selama 10 menit dan dibilas dengan akuades steril. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam
larutan Na-hipoklorit 1,0 selama 5 menit dan dibilas dengan akuades steril. Tahap selanjutnya bahan tanaman direndam dalam larutan HgCl
2
0,1 selama 30 menit, dan dibilas tiga kali dengan akuades steril masing-masing 5 menit. Eksplan
steril dikeringkan di atas cawan petri steril yang berisi kertas saring. Eksplan siap ditanam.
3.4.3 Analisis Histologi
Kalus embriogenik yang terbentuk selanjutnya dilakukan analisis histologi dengan menggunakan metode paraffin yang terdiri dari:
3.4.3.1 Fiksasi
Fiksasi dilakukan dengan cara setiap sampel direndam dalam larutan Formalin 40, Alkohol 70, asam asetat glacial dengan perbandingan 1 : 8 : 1
FAA dengan komposisi 10 ml formalin, 80 ml alkohol, dan 10 ml asam asetat glacial dalam setiap 100 ml larutan direndam minimal selama 24 jam dan
diletakkan dalam vaccum pump. Tujuan perendaman dengan FAA adalah untuk mematikan sel pada sampel secara cepat akan tetapi seolah-olah sampel seperti
kondisi masih segar masih hidup.
3.4.3.2 Dehidrasi
Tujuan dehidrasi untuk menghilangkan air yang ada dalam jaringan tanaman, dilanjutkan dengan penghilangan alkohol. Dehidrasi dilakukan dengan
merendam sampel secara bertahap melalui seri alkohol bertingkat dari alkohol 70 kemudian alkohol 95 sampel masih didalam vaccum lalu alkohol
absolute kemudian sampel dimasukkan kedalam campuran alkohol dan xylol dengan perbandingan 3:1, 1:1, 1:3 secara berturut-turut kemudian sampel
dimasukkan ke dalam larutan xylol I dan xylol II. Masing-masing tahap dehidrasi dilakukan selama minimal 3 jam.
3.4.3.2 Infiltrasi
Infiltasi adalah memasukan parafin secara perlahan-lahan kedalam rongga- rongga yang kosong dalam jaringan tanaman agar tidak terjadi kerusakan sampel
pada saat penyayatan. Pada tahap ini, sampel yang telah direndam dalam xylol diberi serbuk parafin secara perlahan-lahan sampai jenuh. Bahan yang digunakan
adalah xilol dan parafin yang sudah cair dengan perbandingan 3 : 1; 2 : 2; 1 : 3; 1 : 3 volvol; berturut-turut sebanyak tiga kali selama 3 jam dan 0 : 4 volvol
selama 24 jam. Proses ini dilakukan dalam tabung gelas didalam oven pada suhu
55 C setelah kegiatan tersebut selesai, semua parafin diganti dengan parafin murni
pada suhu 60 C. perendaman dengan perafin murni dilakukan minimal selama
satu hari.
3.4.3.4 Embedding
Embedding adalah penanaman sampel yang sudah diproses sebelumnya kedalam blok parafin untuk mempermudah penyayatan. Penanaman dilakukan
pada kotak dari cetakan kertas. Sampel yang sudah difiksasi dimasukkan kedalam cetakan yang telah berisi parafin cair dengan menggunakan pinset. Setelah parafin
mengeras sampel dikeluarkan dari cetakan.
3.4.3.5 Penyayatan
Penyayatan dilakukan dengan menggunakan mikrotom manual. Blok parafin yang sudah jadi dipasang pada pemegang yang terdapat pada mesin
mikrotom putar. Sisi horizontal dari permukaan parafin dibuat sejajar dengan pisau penyayat. Pemegang dapat diatur dengan skrup sedemikian rupa sehingga
ketebalan sayatan sesuai dengan yang dikehendaki. Sayatan yang baik apabila menghasilkan bentuk pita tipis yang lurus dan tidak terputus-putus.
3.4.3.6 Penempelan Sayatan Pada Objek Gelas
Sayatan yang baik ditempelkan pada objek gelas menggunakan zat perekat putih telur Meyer putih telur ditambah air dan gliserin dalam volume yang sama
dan Kristal thinol. Setelah penempelan dilakukan, objek gelas diletakkan pada hot plate dengan suhu 40
C agar sayatan melekat dengan baik, dan sebagian parafin yang mengisi jaringan akan mencair untuk mempercepat proses
penjernihan.
3.4.3.7 Penjernihan
Penjernihan bertujuan untuk menghilangkan parafin dari jaringan dengan cara memasukkan preparat kedalam xilol, xilol - alkohol, alkohol - air hidrasi,
dengan perbandingan 100 xilol, 1 : 1 xilol-alkohol, dan alkohol secara bertahap 100, 95, 70, 50, 30 dan aquades selama 3 menit.
3.4.3.8 Pewarnaan
Pewarnaan bertujuan agar bagian-bagian tertentu dari sel atau jaringan menjadi lebih jelas sehingga mudah untuk diamati. Tahapan pewarnaan meliputi
preparat yang sudah jernih dimasukkan ke dalam larutan pewarna Safranin 1 selama 12 jam. Selanjutnya preparat dicuci dengan aquadest sampai warna benar-
benar hilang. Dehidrasi pada 30, 50, 70, dan 95 ,etanol 2-5 menit langkah. Kemudian preparat dimasukkan kedalam larutan etanol 95 ditambah
larutan Fast Green 2 selama 30 detik, bilas dengan etanol 100 sebanyak dua kali masing-masing selama 2 menit. Selanjutnya preparat didalam larutan karbol
xilol atau campuran metal salisilat dan xilol 1:1 selama 5 detik untuk melepaskan sisa-sisa air yang menempel pada preparat. Kemudian bilas dengan
xilol 100 sebanyak dua kali. Selanjutnya preparat ditutup dengan entellan atau Canada balsm dan diamati dengan mikroskop.
3.5 Parameter yang diamati
Pada penelitian ini parameter yang akan diamati adalah sebagai berikut : 1.
Saat terbentuk kalus primer hari setelah tanam HST 2.
Persentase kultur membentuk kalus primer
Keterangan : a =
jumlah eksplan yang menghasilkan kalus dimedium padat
b =
jumlah seluruh eksplan 3.
Saat terbentuknya kalus embriogenik hari setelah tanam HST 4.
Persentase kalus embriogenik
Keterangan : a = jumlah seluruh kalus embriogenik yang terbentuk b = jumlah seluruh eksplan
5. Berat basah kultur gram
6. Berat kering kultur gram
7. Bagian dari apikal bud yang paling baik sebagai sumber kalus.
8. Morfologi kalus :
a Embrionik : berwarna kuning, padat, nodular terdiri dari embrio
berwarna putih susu b
Non embrionik : berwarna kuning kecoklatan, granular dan halus 9.
Analisa histologi kalus a
Kalus nodular padat b
Sel-sel meristem yang berkembang c
Karakteristik sel embriogenik
3.6 Analisis Data
Kategori