30 Penentuan kondisi optimum proses produksi konsentrat karotenoid
dilakukan dengan penerapan dua tahap optimasi. Tahap pertama yaitu optimasi proses dengan perlakuan nisbah abu sekam padi dan silika gel
bb, sedangkan tahap kedua yaitu optimasi proses dengan perlakuan jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom.
a. Penentuan nisbah abu sekam padisilika gel optimum
Abu sekam padi sebagai adsorben bersifat kurang menjerap karotenoid dan mudah melepaskannya kembali. Sedangkan silika gel
memiliki kemampuan adsorpsi terhadap senyawa karotenoid yang tinggi tetapi kemampuan desorpsinya rendah Masni, 2004. Berdasarkan hal
tersebut, maka dilakukan pencampuran abu sekam padi dan silika gel sebagai adsorben dalam kromatografi kolom dengan harapan kelemahan
dari masing-masing adsorben tersebut dapat tertutupi oleh kelebihan masing-masing adsorben. Nisbah abu sekamsilika gel yang menghasilkan
konsentrat dengan konsentrasi karotenoid dan tingkat pemekatan yang tinggi diseleksi melalui penerapan tiga tingkatan nisbah abu sekam
padisilika gel yaitu 35:5, 30:10, dan 25:15 bb. Pada proses kromatografi, sampel yang telah dilarutkan dalam eluen dimasukkan ke
dalam kolom, dibiarkan terserap dalam penjerap, kemudian dielusi dengan bahan pengelusi yaitu heksana. Jumlah ekstrak yang dilewatkan
dalam kolom yaitu sebanyak 1 g. Cairan yang keluar dari kolom ditampung per fraksi sampai eluat yang keluar tidak berwarna lagi dengan
volume setiap fraksi adalah 3 ml Hasanah, 2006. Konsentrasi karotenoid dari setiap fraksi ditentukan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 446 nm. Fraksi yang menunjukkan konsentrasi karotenoid yang tinggi disatukan dalam satu
tabung reaksi baru, diuapkan pelarutnya dengan jalan dihembus menggunakan gas nitrogen dan kemudian ditentukan konsentrasi
karotenoidnya.
31
b. Penentuan jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom optimum
Jumlah sampel yang dilewatkan dalam kolom yang menghasilkan konsentrat dengan konsentrasi karotenoid dan tingkat pemekatan yang
tinggi diseleksi melalui penerapan empat tingkatan jumlah sampel yaitu 1, 2, 3, dan 4 g. Nisbah abu sekamsilika gel yang digunakan adalah nisbah
abu sekamsilika gel optimum yang terpilih pada tahap sebelumnya. Produk konsentrat karotenoid selanjutnya dikarakterisasi, mencakup
analisis konsentrasi karotenoid, kadar ester dan komposisi asam lemak.
C. METODE PENGAMATAN 1. Analisis Kandungan Karotenoid, Metode Spektrofotometri Parker,
1992
Sampel sebanyak 0.5 g didispersikan dalam 6 ml KOH 5 dalam metanol di dalam tabung reaksi bertutup. Headspace diisi dengan gas
nitrogen, kemudian disaponifikasi pada temperatur 60-70
o
C selama 1 jam di dalam penangas air dengan kondisi gelap. Setiap 10 menit dikocok dengan
vortex. Setelah itu didinginkan dan ditambahkan 2 ml air bebas ion dan 6 ml heksana. Headspace diisi nitrogen, ditutup dan dikocok selama 1 menit.
Kemudian di- sentrifuge, larutan bagian atas dipindahkan ke tabung reaksi yang bersih. Bagian bawah hasil ekstrak pertama diekstrak ulang dengan 6
ml heksana, di- sentrifuge dan lapisan atas ditambahkan ke ekstrak pertama. Selanjutnya kumpulan ekstrak ditambahkan 3 ml asam asetat 5 di
dalam air dan headspace diisi gas nitrogen, ditutup dan dikocok selama 3 menit, di- sentrifuge dan lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung reaksi
bersih dan dievaporasi vakum pada suhu 40
o
C dan kemudian hasil ekstrak ditimbang. Selanjutnya hasil ekstrak dilarutkan dengan 3 ml pelarut
asetonitril:metanol:diklorometana 75:20:5 dan diukur absorbansinya pada = 450 nm dengan spektrofotometer. Kandungan total karotenoid dalam
sampel dihitung dengan menggunakan nilai E
1
1 cm untuk β-karoten =
2600 yaitu absorbansi dari 1 larutan β-karoten 10 mgml atau μgμl pada
