Desain Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Analisis Data

BAB III METODE PENELITIAN

Metodologi penelitian adalah metode eksperimental experimental research untuk mengetahui pengaruh atau hubungan variabel bebas dengan variabel terikat. Variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak air bawang putih EABP, VCO tanpa hidrolisis VCOT dan hasil hidrolisis HVCO serta kombinasinya, sedangkan variabel terikat adalah aktivitas antibakterinya terhadap beberapa bakteri patogen diare. Dengan kata lain, penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh hidrolisis VCO dan kombinasi EABP dan VCO terhadap sifat antibakterinya.

3.1 Desain Penelitian

Penelitian dirancang dengan menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap. Hal ini dikarenakan penelitian menggunakan dua faktor uji yang akan dilihat kaitan ataupun hubungannya antara satu faktor dengan yang lain, yaitu pengaruh konsentrasi VCOT, HVCO, dan EABP terhadap aktivitas antibakterinya. Selanjutnya untuk mengetahui bagaimana pengaruh masing- masing faktor, maka penelitian dimulai dengan pengujian masing-masing faktor, dilanjutkan dengan kombinasinya. Tahap penelitian diawali dengan hidrolisis VCO secara enzimatis pada waktu inkubasi 14 jam Loung, 2014; Elysa, 2014 dan pembuatan ekstrak air bawang putih, yang kemudian diuji aktivitas antibakteri dari masing-masing bahan uji. Selanjutnya dilakukan uji kombinasi ekstrak air bawang putih dengan Universitas Sumatera Utara VCO hasil hidrolisis dan tanpa hidrolisis. Pengujian antibakteri dilakukan sebanyak 5 kali pengulangan untuk setiap kelompok perlakuan.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Sintesis Obat dan Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Medan. Waktu penelitian mulai November 2013 hingga Maret 2014. 3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, blender, buret, hotplate, inkubator, kertas saring Whatman, klem, oven, penangas air, pengaduk magnet, statip, dan alat-alat gelas sesuai kebutuhan.

3.3.2 Bahan

Bahan uji adalah minyak kelapa murni VCO dan bawang putih. Sedangkan biakan bakteri yang digunakan yaitu Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8939, Salmonella thypi ATCC 00786, Shigella dysenteriae ATCC 13313, dan Vibrio cholera ATCC 39315. Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini jika tidak dinyatakan lain, berkualitas pro analis yaitu akuades, n-heksan, natrium hidroksida, kalium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, tris-hidroksimetil aminometana, kalsium klorida, indikator fenolftalein 1 dalam alkohol, natrium klorida 0,9, Lipozyme ® TL IM, dan larutan McFarland No. 0,5. Bahan untuk Universitas Sumatera Utara pembuatan media bakteri yaitu medium nutrient agar, Mueller-Hinton agar, serta akuades bidestilata steril, NaCl 0,9, dan DMSO sebagai pelarut dalam pengujian aktivitas antibakteri. Pencadang yang digunakan adalah pencadang kertas diameter 6 mm Oxoid. Antibiotik pembanding yang digunakan adalah Tetrasiklin HCl.

3.3.3 Pengumpulan bahan uji

Bahan uji bawang putih dan minyak kelapa murni VCO yang dipilih secara purposif. Bawang putih diperoleh dari pasar tradisional Padang Bulan, Medan. Sedangkan sampel VCO adalah Palem Mustika VCO, produksi Siti Nurbaya, Sumatera Barat ada registrasi POM yang jelas. Identifikasi bawang putih dilakukan untuk memperoleh informasi yang pasti terutama tentang varietas sampel. Identifikasi dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI, Bogor. 3.4 Prosedur 3.4.1 Hidrolisis VCO dengan metode enzimatik Sejumlah 30 g VCO ditimbang dalam erlenmeyer 250 ml ditambahkan 50 ml akuades, 12,5 ml CaCl 2 0,063 M, 25 ml larutan buffer Tris-HCl dan 500 mg Lipozyme ® TL IM. Campuran ini diaduk dengan pengaduk magnet selama 10 menit untuk dihomogenkan. Selanjutnya didiamkan selama 14 jam pada suhu 55 ± 0,5 o C Loung, 2014; Elysa, 2014 dan setiap 1 jam inkubasi dilakukan pengocokan selama 10 menit. Setelah waktu hidrolisis tercapai kemudian campuran dipindahkan ke corong pisah, ditambahkan 50 ml n-heksan, diekstraksi dan terbentuk dua lapisan. Lapisan atas fraksi n-heksan dipisahkan sebagai Universitas Sumatera Utara filtrat I. Lapisan bawah dikocok dengan 50 ml n-heksan, setelah didiamkan beberapa saat diambil lapisan atas filtrat II. Filtrat I dan II digabung kemudian ditambahkan 50 mg Na 2 SO 4

3.4.2 Penentuan bilangan asam VCOT dan HVCO

anhidrat dan dibiarkan selama 15 menit dan disaring. Selanjutnya diuapkan diatas penangas air dalam cawan penguap untuk menghilangkan n-heksan. Minyak yang diperoleh sebagai hasil hidrolisis HVCO dan selanjutnya ditentukan bilangan asamnya dan diuji aktivitas antibakterinya Boyer, 1986; Permata, 2012; Satiawihardja, 2001. Penentuan bilangan asam dilakukan dengan cara menimbang sebanyak 5 gram VCOT maupun HVCO di dalam erlenmeyer 200 ml. Minyak tersebut ditambahkan 25 ml alkohol netral 95 dan dipanaskan selama 10 menit dalam penangas air sambil diaduk. Larutan ini kemudian dititrasi dengan KOH 0,1N dengan indikator larutan fenolftalein, sampai tepat terlihat warna merah jambu. Setelah itu dihitung bilangan asam dengan rumus berikut Ketaren, 2005. Bilangan asam = A × N × BM KOH G Keterangan: A = jumlah ml KOH untuk titrasi N = normalitas larutan KOH G = bobot minyak gram BM KOH = 56,1

3.4.3 Pembuatan ekstrak air bawang putih

Metode pembuatan ekstrak air bawang putih berdasarkan modifikasi metode yang dijelaskan Gupta, et al. 2010. Bawang putih dipisahkan per siung dan dicuci dengan air bersih. Bawang putih yang sudah bersih tersebut diambil sebanyak 100 gram kemudian dikupas kulit luarnya dan dipotong kecil-kecil dengan pisau steril. Potongan tersebut kemudian diblender dengan 100 ml Universitas Sumatera Utara akuades bidestilata steril menggunakan blender pada kecepatan sedang. Maserat kemudian disaring dengan corong steril dan kertas saring Whatman. Filtrat yang dihasilkan tersebutlah yang disebut ekstrak air bawang putih EABP.

3.4.4 Penentuan aktivitas antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri VCOT, HVCO, dan EABP dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan pencadang kertas diameter 6 mm. Bakteri yang digunakan adalah Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 8939, Salmonella thypi ATCC 00786, Shigella dysenteriae ATCC 13313, dan Vibrio cholera ATCC 39315. Antibiotik pembanding yang digunakan adalah Tetrasiklin HCl sebagai antibiotik utama untuk diare.

3.4.4.1 Sterilisasi alat

Alat-alat dan bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 170 o C selama 1 - 2 jam dan alat-alat jenis lainnya disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o

3.4.4.2 Pembuatan media nutrient agar

C selama 15 menit, jarum ose dibakar dengan lampu spiritus. Komposisi: Beef Extract 3 g Peptone 5 g Agar 15 g Air suling sampai 1 L Sebanyak 23 gram serbuk Nutrient Agar NA dilarutkan dalam air suling hingga 1 liter dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut sempurna. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Difco Laboratories, 1977. Universitas Sumatera Utara

3.4.4.3 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar

Komposisi: Beef, dehydrated infusion 3 g Casein Hydrolysate 17,5 g Starch 1,5 g Agar 17 g pH 7,3 + 0,2 Sebanyak 38 g media Mueller Hinton Agar MHA dilarutkan ke dalam air suling sedikit demi sedikit kemudian dicukupkan volumenya hingga 1 L dengan bantuan pemanasan sampai semua bahan larut. Media disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121°C selama 15 menit Oxoid, The Manual Laboratories, 2006.

3.4.4.4 Pembuatan agar miring

Media NA steril sebanyak 3 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira 45 o . Kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5 o

3.4.4.5 Pembuatan larutan McFarland No. 0,5

C. Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl 2 1 dicampur dengan 9,95 ml larutan H 2 SO 4 1 dan dikocok homogen. Larutan McFarland No. 0,5 ini setara dengan suspensi sel bakteri konsentrasi 1,5 x 10 8

3.4.4.6 Peremajaan bakteri

cfuml. Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36 - 37 o

3.4.4.7 Pembuatan inokulum

C selama 18 - 24 jam Ditjem POM, 1995. Koloni bakteri diambil dari hasil peremajaan bakteri pada agar miring dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan NaCl fisiologis. Kultur diukur kekeruhan dengan membandingkan Universitas Sumatera Utara kekeruhannya menngunakan baku Mc.Farland 0,5 konsentrasi bakteri 1,5 x 10 8

3.4.4.8 Pembuatan larutan bahan uji

cfuml Ditjen POM, 1995. VCOT, HVCO, dan EABP dilarutkan masing-masing dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 10, 25, 50, 75, dan 100 vv. Blanko sebagai kontrol negatif pada uji VCOT dan HVCO adalah DMSO, sedangkan pada uji EABP, blanko merupakan campuran DMSO dan akuades bidestilata 1:1.

3.4.4.9 Pembuatan larutan Tetrasiklin HCl

Baku pembanding dibuat dalam konsentrasi 5 mgml; 2,5 mgml; 1 mgml; 0,5 mgml; 0,1 mgml; 0,05 mgml; serta 0,01 mgml. Tetrasiklin HCl sebanyak 50 mg dilarutkan dalam 10 ml akuades bidestilata steril konsentrasi 5 mgml, dikocok hingga semua larut. Selanjutnya dilakukan pengenceran menjadi konsentrasi berikutnya yang lebih rendah.

3.4.4.10 Pengujian antibakteri

Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml Mueller Hinton Agar di cawan petri, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada media yang telah padat ditanam pencadang kertas yang sebelumnya telah direndam dalam bahan uji selama 15 menit. Kemudian diikubasi pada suhu 36 - 37 o C selama 24 jam. Selanjutnya masing-masing petri diukur diameter daerah bening di sekitar pencadang disebut zona hambat menggunakan jangka sorong Ditjen POM, 1995; Ugbogu, et al., 2006. Pengujian dilakukan sebanyak 5 kali terhadap VCOT, HVCO, dan EABP. Sebagai pembanding kontrol positif dilakukan prosedur yang sama terhadap 7 konsentrasi Tetrasiklin HCl. Universitas Sumatera Utara

3.4.4.11 Penentuan jenis pelarut untuk uji aktivitas antibakteri

Pilihan pelarut untuk uji adalah akuades, DMSO, serta etanol 96. Hal ini dilakukan untuk menentukan pelarut yang sesuai, dimana memungkinkan bahan uji akan mudah terdispersi ke dalam pencadang kertas, tanpa memberikan aktivitas antibakteri yang berarti. Pengujian antibakteri blanko dilakukan dengan metode difusi dalam petri berisi MHA, dimana pencadang kertasnya telah direndam di dalam pelarut selama 15 menit. Bahan uji dilarutkan dalam masing- masing, kemudian ditentukan juga aktivitasnya. Sehingga akan dipilih pelarut yang tidak memiliki aktivitas antibakteri, namun dapat membantu melarutkan bahan uji dengan baik sehingga antibakterinya optimal.

3.4.4.12 Penentuan pengaruh waktu penyimpanan terhadap aktivitas antibakteri

Penelitian ini menggunakan bahan uji EABP, dimana memiliki zat aktif yang tidak stabil. Sehingga dilakukan pengujian untuk menentukan waktu optimal ekstrak yang memberikan aktivitas yang baik. Dimana EABP disimpan pada suhu kamar selama 24 jam dalam botol gelap, selanjutnya diuji aktivitas antibakterinya. Dilakukan perbandingan dengan pengujian aktivitas antibakteri EABP yang baru dibuat 6 jam dan tidak lebih dari 8 jam.

3.4.4.13 Pengujian aktivitas antibakteri kombinasi bahan uji

Konsentrasi bahan uji yang digunakan adalah konsentrasi yang menunjukkan aktivitas antibakteri paling baik pada pengujian tunggal yaitu konsentrasi 100 Eja, et al., 2011. Perbandingan kombinasi dilakukan adalah VCOT dengan EABP 50:50 ; 75:25 ; 25:75. Perbandingan yang sama juga dilakukan terhadap kombinasi HVCO dengan EABP. Universitas Sumatera Utara

3.5 Analisis Data

Hasil pengujian pembanding Tetrasikin HCl terhadap bakteri uji yang dilakukan pada 7 titik konsentrasi, dikurvakan sebagai kurva pembanding. Sehingga dapat dibandingkan data bahan uji terhadap kurva pembanding Tetrasiklin tersebut. Analisis data yaitu menggunakan teknik Analisis Variansi ANAVA. Bertujuan untuk menguji ada tidaknya perbedaan nilai rata-rata secara signifikan variabel terikat pada dua atau lebih kelompok secara bersamaan. Dimana terdapat perbedaan yang signifikan antara rata-rata tiap kelompok jika probabilitas lebih kecil dari 0,05, dan jika probabilitas lebih besar dari 0,05 maka tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara rata-rata tiap kelompok Walpole, 1993. Selanjutnya untuk membandingkan rata-rata setiap perlakuan, maka dilanjutkan dengan analisis Tukey HSD. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi Bawang Putih

Identifikasi atau determinasi bawang putih dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Bogor menunjukkan bahwa sampel adalah bawang putih Allium sativum L., famili Amaryllidaceae. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1. Ada beberapa genus Allium selain bawang putih yang cukup dikenal, seperti bawang merah Allium cepa L., lokio Allium schoenoprasum L., bawang perai Allium porrum L., shallots Allium ascalonicum L. dan bawang Welsh Allium fistulosum L.. Komponen utama genus ini adalah flavanoid dan cytosolic sycteine sulfoxides alliin yaitu senyawa sulfur organik. Di antara genus Allium tersebut, bawang putih merupakan tumbuhan paling dikenal dan sudah terdapat di seluruh belahan dunia Cobas, et al., 2010; Amagase, et al., 2001; Woodward, 1996; Fenwick dan Hanley, 1985; Block, 1985. Menurut Shobana, et al. 2009, hasil analisis HPLTC menunjukkan senyawa allicin paling banyak terdapat dalam ekstrak air bawang putih 14,64. Allicin pertama kali ditemukan tahun 1944 Robinkov, et al., 1998, yang akan terbentuk saat bawang yang segar dihancurkan sehingga akan terjadi interaksi alliin dan enzim allinase. Allicin merupakan senyawa aktif dan memiliki aktivitas biologis seperti antimikroba, antitrombosit, antidiabetes, antihipertensi, antiarterosklerosis, antivirus, antitumor, antikanker Cobas, et al., 2010. Itulah Universitas Sumatera Utara