3.4.4.3 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar
Komposisi: Beef, dehydrated infusion
3 g
Casein Hydrolysate 17,5
g Starch
1,5 g
Agar 17
g pH 7,3 + 0,2
Sebanyak 38 g media Mueller Hinton Agar MHA dilarutkan ke dalam air suling sedikit demi sedikit kemudian dicukupkan volumenya hingga 1 L dengan
bantuan pemanasan sampai semua bahan larut. Media disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121°C selama 15 menit Oxoid, The Manual Laboratories, 2006.
3.4.4.4 Pembuatan agar miring
Media NA steril sebanyak 3 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring
kira-kira 45
o
. Kemudian disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5
o
3.4.4.5 Pembuatan larutan McFarland No. 0,5
C.
Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl
2
1 dicampur dengan 9,95 ml larutan H
2
SO
4
1 dan dikocok homogen. Larutan McFarland No. 0,5 ini setara dengan suspensi sel bakteri konsentrasi 1,5 x 10
8
3.4.4.6 Peremajaan bakteri
cfuml.
Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi
dalam inkubator pada suhu 36 - 37
o
3.4.4.7 Pembuatan inokulum
C selama 18 - 24 jam Ditjem POM, 1995.
Koloni bakteri diambil dari hasil peremajaan bakteri pada agar miring dengan jarum ose steril lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml
larutan NaCl fisiologis. Kultur diukur kekeruhan dengan membandingkan
Universitas Sumatera Utara
kekeruhannya menngunakan baku Mc.Farland 0,5 konsentrasi bakteri 1,5 x 10
8
3.4.4.8 Pembuatan larutan bahan uji
cfuml Ditjen POM, 1995.
VCOT, HVCO, dan EABP dilarutkan masing-masing dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 10, 25, 50, 75, dan 100 vv. Blanko
sebagai kontrol negatif pada uji VCOT dan HVCO adalah DMSO, sedangkan pada uji EABP, blanko merupakan campuran DMSO dan akuades bidestilata 1:1.
3.4.4.9 Pembuatan larutan Tetrasiklin HCl
Baku pembanding dibuat dalam konsentrasi 5 mgml; 2,5 mgml; 1 mgml; 0,5 mgml; 0,1 mgml; 0,05 mgml; serta 0,01 mgml. Tetrasiklin HCl sebanyak
50 mg dilarutkan dalam 10 ml akuades bidestilata steril konsentrasi 5 mgml, dikocok hingga semua larut. Selanjutnya dilakukan pengenceran menjadi
konsentrasi berikutnya yang lebih rendah.
3.4.4.10 Pengujian antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15 ml
Mueller Hinton Agar di cawan petri, kemudian dibiarkan sampai media memadat.
Pada media yang telah padat ditanam pencadang kertas yang sebelumnya telah direndam dalam bahan uji selama 15 menit. Kemudian diikubasi pada suhu 36 -
37
o
C selama 24 jam. Selanjutnya masing-masing petri diukur diameter daerah bening di sekitar pencadang disebut zona hambat menggunakan jangka sorong
Ditjen POM, 1995; Ugbogu, et al., 2006. Pengujian dilakukan sebanyak 5 kali terhadap VCOT, HVCO, dan EABP. Sebagai pembanding kontrol positif
dilakukan prosedur yang sama terhadap 7 konsentrasi Tetrasiklin HCl.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4.11 Penentuan jenis pelarut untuk uji aktivitas antibakteri
Pilihan pelarut untuk uji adalah akuades, DMSO, serta etanol 96. Hal ini dilakukan untuk menentukan pelarut yang sesuai, dimana memungkinkan bahan
uji akan mudah terdispersi ke dalam pencadang kertas, tanpa memberikan aktivitas antibakteri yang berarti. Pengujian antibakteri blanko dilakukan dengan
metode difusi dalam petri berisi MHA, dimana pencadang kertasnya telah direndam di dalam pelarut selama 15 menit. Bahan uji dilarutkan dalam masing-
masing, kemudian ditentukan juga aktivitasnya. Sehingga akan dipilih pelarut yang tidak memiliki aktivitas antibakteri, namun dapat membantu melarutkan
bahan uji dengan baik sehingga antibakterinya optimal.
3.4.4.12 Penentuan pengaruh waktu penyimpanan terhadap aktivitas antibakteri
Kategori