3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian berjudul “Pengujian Biji Pala Myristica sp. sebagai Bahan Anestesi Lobster air tawar Cherax quadricarinatus
” dilaksanakan di Laboratorium Bahan Baku dan Industri Hasil Perairan, Departemen Teknologi
Hasil Perairan; Laboratorium Lingkungan, Departemen Budidaya Perairan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini
dilaksanakan pada bulan Oktober 2011 hingga bulan Maret 2012.
3.2 Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah lobster air tawar
dengan bobot rata-rata 63,23±4,52 gekor Lampiran 1 dan biji pala kering
komersil. Bahan pembantu terdiri dari akuades uji amonia, air untuk media hidup lobster, pakan berupa pelet komersil dengan merek “BFC” khusus untuk
lobster, serta es batu untuk mendinginkan media spons dan es dalam botol bekas yang akan digunakan dalam uji penyimpanan.
Alat yang digunakan antara lain : akuarium, baskom, filter, aerator, ember dan plasik hitam, baskom, gelas ukur bervolume 10 ml, 100 ml, dan 1000 ml,
beaker galss 50 ml, spatula, multimeter, spatula, pipet volumetrik,
spektrofotometer dan pH meter, spons sebagai media pengemasan, styrofoam, termometer dan botol plastik dan botol kaca bekas.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan bertujuan mengetahui ambang
konsentrasi ekstrak biji pala yang akan digunakan sebagai bahan anestesi bagi kelangsungan hidup lobster. Tahap penelitian pendahuluan terdiri dari aklimatisasi
lobster air tawar, persiapan ekstrak biji pala, persiapan media penyimpanan, dan pengujian konsentrasi ambang ekstrak biji pala. Tahap, prosedur, serta
pengamatan dalam penelitian pendahuluan terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2 Tahapan, prosedur, dan parameter pengamatan penelitian pendahuluan No kegiatan
Prosedur parameter
pengamatan 1
Aklimatisasi lobster air tawar
pengadaptasian lobster dalam akuarium
mortalitas lobster air tawar
2 Persiapan ekstrak biji
pala penghancuran biji pala
kemudian dilakukan perebusan remahan biji
pala, setelah itu air rebusan disaring untuk
memisahkan endapan dan cairan biji pala, biji
pala ini selanjutnya digunakan sebagai bahan
anestesi karakteristik air
rebusan biji pala, misalnya warna
dan endapan
3 Persiapan media
penyimpanan persiapan styrofoam dan
media kapasitas
styrofoam dan
suhu media spons
4 Pengujian konsentrasi
ambang ekstrak biji pala pendedahan 5 ekor
lobster air tawar uji selama 48 jam pada
beberapa konsentrasi bahan anestesi yang
berbeda mortalitas lobster
air tawar.
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk memperoleh pedoman untuk penelitian utama. Tahap penelitian utama terdiri dari pengujian toksisitas letal
akut ekstrak biji pala terhadap lobster, pengujian daya anestesi ekstrak biji pala pada lobster, serta pengujian penyimpanan lobster. Tahapan, prosedur, serta
parameter yang diamati dapat dilihat pada Tabel 3.
3.3.1 Aklimatisasi lobster air tawar Cherax quadricarinatus
Lobster air tawar diadaptasikan dalam akuarium sebelum dilakukan pengujian. Akuarium yang digunakan untuk adaptasi berukuran 60x30x30 cm
3
. Air yang digunakan adalah air tanah air sumur yang telah diendapkan selama
dua hari untuk menghilangkan klorin dan endapan racun lainnya. Selama aklimatisasi, lobster juga diberi aerasi dengan tujuan meningkatkan kandungan
oksigen terlarut dalam media uji.
Tabel 3 Tahapan, prosedur, dan parameter pengamatan penelitian utama No
kegiatan Prosedur
parameter pengamatan
1 Pengujian toksisitas letal
akut ekstrak biji pala pendedahan 4 ekor
lobster air tawar uji selama 48 jam pada 5
konsentrasi uji yaitu 3 ppt; 4 ppt; 5 ppt; 6
ppt; 7 ppt; dan 8 ppt mortalitas lobster
air tawar pada waktu dedah 24
dan 48 jam berdasarkan
perubahan konsentrasi
2 Pengujian daya anestesi
ekstrak biji pala 5 ekor lobster air
tawar uji dipingsankan dengan
5 konsentrasi kemudian dibugarkan
kembali waktu pingsan
menit, waktu pemulihan menit,
dan perubahan kondisi fisiologis
saat pemingsanan maupun saat
pembugaran
3 Pengujian penyimpanan
lobster 5 ekor lobster uji
dipingsankan dengan tiga konsentrasi
berbeda, yakni 5 ppt; 7 ppt; dan 8 ppt
kemudian diuji penyimpanan dengan
lama waktu; 12 jam ; 24 jam; 36 jam ; dan
48 jam jumlah lobster air
tawar yang sadar kembali setelah
dilakukan pembugaran.
3.3.2 Persiapan ekstrak biji pala
Ekstrak biji pala merupakan hasil dari perebusan remahan biji pala. Sebelum dilakukan perebusan, biji pala ditimbang terlebih dahulu, kemudian
ditumbuk hingga menjadi remahan. Remahan biji pala ditimbang kembali kemudian direbus dalam air hingga mendidih dalam 100 ml air terdapat ± 6 g
remahan biji pala. Setelah mendidih, kemudian diangin-anginkan pada suhu ruang. Setelah itu dilakukan pemisahan antara air dengan endapan dengan cara
penyaringan. Saringan yang digunakan adalah saringan teh. Filtrat kemudian dimasukkan dalam botol tempat penyimpanan bahan yang terbuat dari kaca.
Filtrat ekstak biji pala digunakan sebagai bahan anestesi untuk uji selanjutnya. Ekstrak biji pala yang dihasilkan dari proses tersebut ± 90 ml.
3.3.3 Persiapan wadah dan media pengisi
Transportasi lobster dilakukan dengan menggunakan kotak styrofoam bervolume 40x26x17 cm
3
. Jumlah kepadatan 5 ekor lobster dalam masing-masing kotak Styrofoam. Media pengisi yang digunakan adalah spons. Sebelum
digunakan sebagai media, spons terlebih dahulu didinginkan pada air yang bersuhu 12
– 15
o
C. Pendinginan bertujuan menjaga kestabilan suhu tetap rendah sekitar selama uji penyimpanan.
3.3.4 Penentuan konsentrasi ambang ekstrak biji pala
Konsentrasi ekstrak biji pala yang digunakan dalam pengujian ambang konsentrasi yakni sebesar 0 kontrol negatif; 2,5 ppt; 5 ppt; 7,5 ppt; 10 ppt;
12,5 ppt dan 15 ppt. Penentuan konsentrasi uji bersifat uji coba. Selama penentuan ambang konsentrasi, lobster air tawar tidak diberi aerasi dan tidak diberi pakan.
Pengamatan dilakukan pada jam ke 24 dan jam ke 48 terhitung mulai lobster dimasukkan ke dalam wadah percobaan.
3.3.5 Uji toksisitas letal akut ekstrak biji pala
Pengujian toksisitas letal menggunakan enam konsentrasi bahan uji serta sebuah perlakuan kontrol negatif yaitu tanpa menggunakan ekstrak biji pala.
Dalam penelitian ini digunakan konsentrasi ekstrak biji pala pada selang 3 hingga 8 ppt dengan interval 1 ppt. Konsentrasi ekstrak biji pala yang digunakan dalam
uji toksisitas letal adalah 3; 4; 5; 6; 7 dan 8 ppt. Konsentrasi tersebut merujuk pada persentase mortalitas pada pengujian ambang konsentrasi, yaitu konsentrasi
yang menyebabkan kematian lobster hingga 100 dalam waktu 24 jam dan konsentrasi yang tidak menyebabkan kematian lobster mortalitas 0 selama
24 jam. Uji toksisitas yang dgunakan dalam penelitian bersifat akut.
3.3.6 Penentuan daya anestesi ekstrak biji pala
Konsentrasi ekstrak biji pala yang digunakan dalam uji daya anestesi adalah konsentrasi yang menyebabkan kematian lobster hingga 50 LC
50
-24 jam hingga mortalitasnya dibawah 100 . Konsentrasi ekstrak biji pala yang
digunakan adalah sebesar 5 ppt; 6 ppt; 7 ppt; dan 8 ppt. Selama pengujian daya anestesi, media uji tidak diberi aerasi dan lobster
uji tidak diberi pakan. Pengamatan dilakukan dan dicatat secara kumulatif pada
menit ke 0, 30, 60, 120, 240, dan seterusnya sampai hewan uji pingsan. Setelah
mencapai waktu dedah yang telah ditentukan, lobster air tawar dipindahkan ke media air bersih yang telah diberi aerasi. Pengamatan waktu pulih sadar
ditentukan dengan mengamati tingkah laku lobster air tawar hingga mencapai keadaan normal kembali keseimbangan dan reaksi terhadap pengaruh luar
menjadi normal kembali.
3.3.7 Pengujian penyimpanan lobster
Tahap pertama yang dilakukan sebelum penyimpanan lobster adalah memingsankan lobster dengan mendedahkannya dalam media air berisi ekstrak
biji pala hingga lobster memasuki fase deep sedation. Konsentrasi yang digunakan untuk mendedahkan lobster sebesar 5 ppm, 7 ppm, dan 8 ppm. Lobster
dikatakan mengalami fase deep sedation, apabila sedikit ada pergerakan kaki renang, respon berkurang ketika terusik benda asing, tetapi masih terdeteksi
denyut nadi di kepalanya. Setelah melewati fase tersebut, kemudian lobster uji dimasukkan ke dalam kotak styrofoam berisi spons dengan suhu berkisar antara
12 - 15
o
C. Penyusunan lobster dalam kotak styrofoam dilakukan dengan cara meletakkan lobster di atas media spons. Lobster diletakkan dalam styrofoam
dengan posisi membujur mengikuti lebar styrofoam. Dasar styrofoam diberi botol yang berisi es Gambar 5.
Gambar 4 Penyusunan lobster dalam media penyimpanan Lobster disimpan dalam suhu ruang selama 12 jam; 24 jam; 36 jam dan 48
jam. Setelah selesai uji penyimpanan, lobster kembali dibugarkan dengan cara didiamkan pada suhu ruang terlebih dahulu selama ± 10 menit, kemudian
dimasukkan dalam wadah yang berisi sedikit air dan didiamkan selama ± 1-3 jam. Kondisi lobster diamati hingga dapat merespon rangsangan dari luar. Setelah itu
lobster kembali dimasukkan dalam akuarium tanpa diberi pakan terlebih dahulu hingga 12 jam. Perhitungan presentase lobster hidup menggunakan rumus sebagai
berikut :
lobster hidup = jumlah lobster hidup saat pembugaran
Jumlah lobster awal x 100
3.4 Analisis Analisis yang dilakukan terhadap media air pada uji toksisitas letal meliputi
pengukuran oksigen terlarut, pengukuran suhu, pengukuran pH, dan pengukuran kandungan amoniak.
3.4.1 Pengukuran kandungan DO, pH, dan suhu
Pengukuran DO, pH, dan suhu suhu media pada uji toksisitas letal dilakukan dengan alat multimeter dengan sistem digital. Parameter yang diukur
adalah pH, suhu, dan oksigen terlarut.
3.4.2 Pengukuran suhu media penyimpanan
Pengukuran suhu dilakukan dengan termometer. Termometer yang digunakan berskala 0 - 80
o
C. Pengukuran suhu berlangsung di tempat pengujian dengan cara memasukkan termometer ke dalam akuarium pengujian. Suhu yang
terukur adalah suhu pengujian.
3.4.3 Pengukuran Kandungan TAN total ammonia nitrogen Effendi 2000
Uji kandungan amoniak adalah sebagai berikut : a.
10 ml air sampel dipipet dan dimasukkkan ke dalam gelas piala. b.
Ditambahkan 1 tetes MnSO
4
, 0.6 ml kloroks dan 0.6 ml fenat ke dalam gelas piala yang telah berisi air sampel, kemudian diaduk dan didiamkan
15 menit sampai terbentuk warna yang stabil. c.
Larutan blanko yang digunakan adalah aquades dengan jumlah yang sama dengan air sampel yaitu 10 ml. Air aquades tersebut dipipet kemudian
dimasukkan dalam gelas piala. d.
Larutan standar dibuat dari larutan amonia komersil 1 mgL, kemudian dipipet dan dimasukkan dalam gelas piala.
e. Pengukuran panjang gelombang larutan sampel, larutan blanko, dan
larutan standar dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm dan absorbansi 0,0000 transmiter 100.
f. Konsentrasi amonia total dihitung dengan persamaan :
Mg NH3L = Cst x Abs sampel
− Abs blanko Abs standar
− Abs blanko
Cst : konsentrasi larutan standar 1 mgL
Abs sampel : nilai absorbansi larutan sampel
Abs standar : nilai absorbansi larutan standar
Abs blanko : nilai absorbansi larutan blanko
3.4.4 Rancangan percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor yaitu pengaruh konsentrasi terhadap lama pemingsanan.
Percobaan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Model matematika rancangan perobaan yang dilakukan adalah sebagai berikut:
Y
ij
= µ + X
ij
+ ∑ij Keterangan:
Y
ij
: nilai pengamatan pada suatu percobaan yang memperoleh perlakuan pada taraf ke-i dengan ulangan-j
µ : pengaruh nilai rata-rata umum
X
ij
: pengaruh perlakuan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j ∑ij : Pengaruh galat percobaan karena perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
i : Perlakuan dalam percobaan
j : ulangan percobaan
Hasil analisis data yang menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata, diolah dengan uji lanjut menggunakan uji lanjut Tukey Multiple comparisons.
Pengolahan data statistik dilakukan dengan menggunakan software IBM-SPSS 13.0 for Windows.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Konsentrasi Ambang
Uji konsentrasi ambang bertujuan mengetahui tingkat konsentrasi ekstrak biji pala yang akan digunakan pada uji selanjutnya yaitu uji toksisitas letal akut. Konsentrasi
yang menjadi ambang batas bawah adalah konsentrasi tertinggi yang tidak menyebabkan kematian bagi lobster, sedangkan konsentrasi yang menjadi ambang batas atas adalah
konsentrasi terendah yang menyebabkan kematian lobster hingga 100. Uji konsentrasi ambang dilakukan selama 24 jam. Hasil pengamatan uji konsentrasi ambang disajikan
pada Tabel 4. Tabel 4 Mortalitas lobster pada uji konsentrasi ambang
Konsentrasi ppt Jumlah kematian
tanpa ekstrak 2,5
5 50
7,5 50
10 100
12,5 100
15 100
Tabel 4 mengindikasikan bahwa konsentrasi tertinggi yang menyebabkan mortalitas lobster sebesar 0 dalam waktu 24 jam LC
-24 jam terjadi pada perlakuan kontrol dan pemberian ekstrak biji pala sebesar 2,5 ppt. Mortalitas lobster sebesar 50
dalam waktu 24 jam LC
50
-24 jam terjadi pada konsentrasi 5 ppt dan mortalitas lobster hingga 100 LC
100
-24 jam terjadi pada konsentrasi 10 ppt, 12,5 ppt, dan 15 ppt. Maka selanjutnya, konsentrasi yang akan digunakan dalam uji toksisitas letal akut adalah
konsentrasi antara 2,5 - 10 ppt. Biji pala mengandung beberapa senyawa yang dalam kadar tertentu bersifat
toksik bagi lobster. Senyawa berbahaya yang diketahui terdapat pada ekstrak biji pala terutama pada fixed oil nutmeg oil adalah myristicin, senyawa ini berwarna oranye,
sangat wangi dan mempunyai konsistensi seperti mentega pada suhu kamar Guenther 1972 diacu dalam Pratiwi 2000. Gejala yang ditimbulkan akibat keracunan senyawa
myristicin adalah dilatasi mata dan detak jantung yang lebih cepat. Mengacu pada sifat
myristicin tersebut, diduga pada konsentrasi lebih dari 10 ppt merupakan konsentrasi
yang bersifat sangat toksik bagi kelangsungan hidup lobster.
4.2 Uji Toksisitas
Kategori