Enzim-Enzim Pendegradasi Kitin Biological Activity of Oligomer Chitin Hydrolyzate Produced Using Chitinase Enzymes from SSA2B4.1 (Bacillus cereus SW41) Isolate on Lymphocytes and Cancer Cells Lines.

produk berupa oligomer kitin, sedangkan tipe pemotongan eksokitinase menghasilkan produk berupa monomer kitin N-asetilglukosamin dan oligomer kitin. Sebagai konsekuensi dari sifat ini, laju keseluruhan dari hidrolisis kitin dibatasi oleh kerja endokitinase, yang secara drastis meningkatkan konsentrasi substrat efektif bagi N-asetilglukosaminidase. Proses pengubahan kitin menjadi turunan oligosakarida secara kimiawi oleh asam cenderung dihindari karena proses ini tidak dapat dikontrol, menghasilkan lebih banyak monomer D-glukosamin dan lebih sedikit kitooligomer, padahal yang memiliki aktivitas biologi penting adalah senyawa- senyawa kitooligomernya Kolodzeiesjka et a l ì 2000, Curroto dan Aros 1993. Aplikasi enzim yang menghasilkan oligomer dari kitin dengan ukuran spesifik jauh lebih menguntungkan dibandingkan dengan hidrolisis kimia kitin yang cenderung menghasilkan monomer, karena ukuran spesifik produk oligomer trimer sampai heksamer berkaitan erat dengan sifat fisiologis dan bioaktifnya. Aplikasi enzim-enzim pemodifikasi dan pengurai senyawa kitin dan turunannya sangat diperlukan untuk menghasilkan senyawa kitooligosakarida. Ukuran molekul produk akhir hidrolisis, yaitu senyawa oligomer kitin dan kitosan sangat penting diperhatikan, karena sifat fungsional bergantung pada berat molekulnya dan memiliki aktivitas biologi penting adalah senyawa oligomernya Curroto dan Aros 1993, Suzuki 1996, Kolodziejska et a l ì 2000. Berdasarkan hasil penelitian Wahyuni 2006 oligomer kitosan yang diproduksi secara enzimatik menggunakan enzim kitosanase dari íîï illu s lich en iformis MB2 yang berasal dari sumber air panas Tompaso Manado, memiliki aktivitas imunostimulan dan penghambat proliferasi beberapa jenis sel kanker HeLa, A549, K562, dan KR-4 secara in vitro yang lebih baik dibanding kitosannya sendiri. Agustine 2005 juga mendeteksi adanya kemampuan oligomer kitin yang dihasilkan dari Bacillus licheniformis MB2 mengaktifkan proliferasi sel limfosit secara in vitro. Depolimerisasi kitin menjadi oligomer kitin dapat dilakukan dengan asam organik atau dengan hidrolisis enzimatik. Penggunaan asam nitrat, asam fosfat, HCl, dan HF mampu memotong polimer kitin menjadi unit-unit yang lebih rendah, tetapi prosesnya memakan waktu dan mengakibatkan deasetilasi dari produknya, selain itu lebih banyak monomer yang dihasilkan dibanding oligomer Defaye et a l ð 1989; Hasegawa et a l ð 1993. Sebaliknya hidrolisis kitin oleh enzim sangat efisien karena prosesnya dapat dikontrol dengan tepat. Biasanya bakteri menghasilkan beberapa kitinase untuk menghidrolisis berbagai bentuk kitin yang terdapat di alam dan dimanfaatkan oleh mikroba sebagai sumber karbon Wang dan Chang, 1997; Yanai et a l ðñ 1992. Kitinase dihasilkan oleh bakteri, insekta, kapang, tanaman dan hewan. Gooday, 1990, Patil et a l . 2000. Diantara bakteri penghasil kitinase tercatat òóô illu s , õö ÷ u d o m øù ó ö ñ Vibrios, Actinomycetes, dan Clostridia Ueda dan Arai 1992, Wang dan Chang 1997, Sakai et al. 1998, Patil et al. 2000. Keuntungan menggunakan mikrob sebagai sumber enzim antara lain mikrob dapat tumbuh relatif cepat, bahan baku relatif murah, mudah diisolasi, dan terbuka peluang untuk meningkatkan mutu enzim melalui rekayasa genetika Madigan et al. 2000. Informasi tentang mikroba penghasil enzim kitinase telah dilaporkan oleh beberapa peneliti, antara lain kitinase dari Streptomyces cursanovii 37 o C telah dilaporkan oleh Ilyina et al. 2000. Kitinase yang berasal dari fungi dilaporkan oleh Kuranda dan Robin 1991, yang mengisolasi kitinase dari S.cerevisiae, M. Rouxii oleh Meyer 1997, Benjaminiella poitrasii oleh Ghormade et al., 2000, dan A. bisporus oleh Rast., et al 2003 Karakteristik enzim kitinase yang berasal dari Bacillus cereus SW41dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2. Karakteristik enzim kitinase dari Bacillus cereus SW41 No Parameter Karakteristik 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Suhu optimum pH optimum Buffer optimum Berat molekul Aktivator Spesifitas substrat Tahan terhadap jenis denaturan 70 o C 4.0 6.0 Buffer phosphate 0.05 pH 4 130,2 kDa Mn dan Ca Koloidal kitin Guanidin, urea dan NaCl Sumber : Wahyuni 2010

C. Larva Udang Artemia salina

Uji bioaktivitas adalah uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip uji bioaktivitas adalah suatu komponen senyawa bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan pada dosis yang tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas. Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk uji tersebut adalah larva udang atau úû ü em ia sa lin a . úû ü em ia merupakan kelompok udang-udangan dari p h ylu m úû ü h ro p o d a . Mereka berkerabat dekat dengan zooplankton lain seperti co p ep o d e dan d a p h n ia kutu air. úû ü em ia hidup di danau-danau garam berair asin yang ada diseluruh dunia. Udang ini toleran terhadap selang salinitas yang sangat luas, mulai dari hampir tawar hingga jenuh garam. Secara alamiah salinitas danau dimana mereka hidup sangat bervariasi, tergantung pada jumlah hujan dan penguapan yang terjadi. Apabila konsentrasi garam kurang dari 6 telur úû ü em ia akan tenggelam sehingga telur tidak bisa menetas, hal ini biasanya terjadi apabila air tawar banyak masuk ke dalam danau dimusim penghujan. Sedangkan apabila konsentrasi garam lebih dari 25 telur akan tetap berada dalam kondisi tersuspensi, sehingga dapat menetas dengan normal. Metode uji ý û þ n e ÿ û þ m p Lethality Test Uji BSLT ini menggunakan larva Artemia salina. Kemampuan bioaktivitas diketahui berdasarkan jumlah kematian larva udang akibat pemberian ekstrak. Ekstrak bersifat sitotoksik bila harga LC50- nya 1000 ppm Meyer et al. 1982. Metode ini mempunyai beberapa keuntungan antara lain, waktu pelaksanaan cepat, biaya relatif murah, pengerjaan sederhana, tidak memerlukan teknik aseptik, tidak memerlukan peralatan khusus, menggunakan sampel dalam jumlah relatif sedikit dan tidak memerlukan serum hewan seperti pada uji sitotoksik Meyer, et al. 1982. Hasil bioassay terhadap senyawa-senyawa tersebut menggunakan udang Artemia salina menunjukkan sifat sitotoksik yang tinggi Ersam, et al. 2003. Artemia salina Leach merupakan hewan coba yang digunakan untuk praskrining aktivitas antikanker di National Cancer Institute, Amerika Serikat Meyer, et al. 1982.

D. Limfosit Dalam Sistem Imun

Limfosit adalah sel darah putih leukosit yang mampu menghasilkan respon imun spesifik terhadap berbagai jenis antigen yang berbeda. Limfosit