Metode yang lebih sederhana untuk penghitungan jumlah sel yang berproliferasi adalah metode pewarnaan MTT 3-4,5-Dimethyl-2-thiazoly-2,5-
diphenyl-2H-tetrazolium bromide. Prinsip metode MTT adalah konversi MTT menjadi senyawa formazan yang berwarna ungu oleh aktivitas enzim suksinat
dehidrogenase dari mitokondria sel hidup Kubota et a l
. 2003. Reaksi yang terjadi digambarkan pada Gambar 4. Jumlah senyawa formazan yang terbentuk
adalah proporsional dengan jumlah sel limfosit yang hidup. Selain dengan metode MTT, perhitungan sel dapat dilakukan dengan metode pewarna tripan biru, yang
hanya dapat mewarnai jika membran sel telah rusak, sehingga dapat digunakan untuk membedakan sel hidup dan sel yang mati atau rusak. Sel yang hidup tidak
akan berwarna dan berbentuk bulat, sedangkan sel mati akan berwarna biru dan mengkerut Bird dan Forrester, 1981.
Gambar 4. Mekanisme reaksi Reduksi MTT menjadi MTT formazan oleh enzim suksinat dehidrogenase Kubota et a
l . 2003
Beberapa senyawa yang telah diketahui mampu meningkatkan proliferasi sel limfosit adalah : vitamin C dan E Budiharto, 1997, ekstrak bawang putih
Lastari, 1998, ekstrak tanaman cincau hijau Pandoyo, 2000 ekstrak air kayu secang
a esa
lp in
ia sa
p p
a n
Linn Puspaningrum, 2003, teh daun dan serbuk gel cincau
yclea Setiawati, 2003, bunga kumis kucing Orthosimphon stamineus
benth dan bunga knop Gomphrena globosa L. Aquarini, 2005, dan kitooligomer kitin Agustine, 2005. Senyawa-senyawa tersebut bekerja melalui
mekanisme menginduksi proliferasi sel limfosit.
3. Mitogen sebagai Senyawa Pemacu Proliferasi Sel Limfosit
Mitogen adalah sumber ligand polipeptida yang dapat berikatan dengan reseptor yang terdapat pada permukaan sel. Beberapa mitogen merupakan factor
pertumbuhan yang mengaktivasi tirosin kinase. Aktivasi tersebut diawali oleh mitogen yang mengakibatkan adanya urut-urutan sinyal yang berpengaruh
terhadap berbagai faktor transkripsi dan berpengaruh terhadap aktivitas gen di dalam sel Decker, 2001.
Beberapa molekul pada patogen mampu berikatan dengan molekul permukaan limfosit yang bukan merupakan reseptor antigen. Jika pengikatan ini
mampu menginduksi limfosit untuk membelah mitosis, maka molekul tersebut disebut mitogen. Mitogen menginduksi proliferasi limfosit pada frekuensi tinggi
tanpa memerlukan adanya spesifisitas antigen, disebut dengan aktivasi poliklonal. Beberapa mitogen hanya mampu menginduksi proliferasi sel B, beberapa hanya
berpengaruh pada sel T, dan ada juga yang mampu menginduksi keduanya. Beberapa mitogen disebut antigen T-independen, karena mampu menginduksi sel
B untuk mensekresinantibodi tanpa ada bantuan dari sel Th Decker, 2001. Lektin pada umumnya adalah mitogen yang merupakan protein yang
berikatan dengan senyawa karbohidrat. Concavalin A Con A dan Fitohemaglutinin PHA mempunyai struktur tetramer dengan setiap monomernya
memiliki satu situs pengikat karbohidrat, sehingga dapat mengikat glikoprotein pada permukaan sel. Pokeweed PWM berasal dari tumbuhan pokeweed
to la
cca erica
n a
. PMW mampu berikatan dengan di-N-asetyl kitobiose dan mampu menginduksi baik sel B dan sel T Kuby 1992. Lektin Con A adalah
mitogen asal legum yang bersifat sebagai imunomodulator karena dapat meransang proliferasi limfosit. Menurut Kresno 1996 sebanyak 50-60 sel
limfosit T mampu memberikan respon terhadap stimulasi dengan mitogen PHA dan Con A. Lipopolisakarida LPS juga mampu berfungsi sebagai mitogen, tetapi
pengaruhnya hanya pada sel B Kuby 1992. Respon terhadap mitogen tersebut dianggap menyerupai respon limfosit terhadap antigen, sehingga uji transformasi
dengan ransangan mitogen tersebut banyak dipakai untuk menguji fungsi limfosit. Stimulasi limfosit dengan antigen maupun mitogen mengakibatkan berbagai
reaksi biokimia di dalam sel, diantaranya fosforilasi nukleoprotein, pembentukan DNA dan RNA, peningkatan metabolisme lemak dan lain-lain Letwin dan
Kuimby 1987. Lektin dan fitohemaglutinin PHA adalah protein non enzimatik, berikatan
dengan karbohidrat secara reversibel. Fungsi biologis dari lektin adalah kemampuan mengenal dan berikatan dengan struktur karbohidrat spesifik,
khususnya berikatan dengan oligosakarida. Lektin dapat berikatan dengan berbagai sel yang memiliki molekul permukaan berupa glikoprotein atau
glikolipid. Beberapa gugus spesifik lektin telah didentifikasi seperti mannose, galaktosa, N-asetiglukosamin, N-asetilgalaktosamin, L-fruktosa, dan asam N-
asetilneraminik. Sub unit lektin saling berhubungan satu dengan yang lain melaui ikatan non kovalen atau ikatan-ikatan disulfida. Beberapa lektin membutuhkan
kation devalen seperti kalsium, magnesium dan mangan untuk berikatan dangan karbohidrat. Lektin terdiri dari enam famili yang telah dikenal yaitu: lektin legum,
lektin sereal, lektin jenis P, C, S dan pentraxis Letwin dan Quimby 1987.
E. Kultur Sel
Kultur secara in vitro
merupakan suatu cara untuk mengembangbiakkan atau menumbuhkan sel di luar tubuh hewan atau manusia. Lingkungan atau bahan
makanan untuk pertumbuhan sel secara in vitro
diusahakan menyerupai keadaan sel secara in
vivo . Oleh karena itu, diperlukan suatu media pertumbuhan yang
berisi asam-asam amino, vitamin, mineral, garam-garam anorganik, glukosa dan serum. Peranan serum dalam medium biakan sangat penting yaitu sebagai nutrien
untuk pertumbuhan sel serta fungsinya dalam pelekatan sel. Serum memberikan hormon-hormon penting, faktor penempel sel ke matriks tempat sel tumbuh,
protein, lipid serta mineral-mineral yang diperlukan sebagian besar jenis sel untuk tumbuh dan berkembang. Sel yang dikultur dapat berupa suatu galur sel, yaitu
populasi sel yang berasal dari suatu sumber jaringan tertentu yang mengalami pengkulturan lebih lanjut, hingga mencapai sub kultur.
Kultur sel dari jaringan sel kanker diperbanyak dibawah kondisi yang sesuai sampai sel dapat menggunakan semua substrat, menjadi sangat padat
terlihat dekat satu sama lain atau mencapai konfluen. Setelah mencapai
