sebelum dianalisis dengan HPLC terlebih dahulu disentrifus untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang dapat mempengaruhi pembacaan alat HPLC.
Identifikasi dan fraksinasi dengan HPLC menggunakan kolom karbohidrat waters sebagai fase diam, dan pelarut asetonitril 60 dalam air sebagai fase
gerak. Deteksi dilakukan berdasarkan waktu retensi, dengan detektor UV model 440 dual lamdha, menggunakan volume injeksi sampel sebanyak 20 l dan laju
alir 1 mlmenit. Sebagai standar digunakan senyawa oligomer campuran dari seikagaku Japan, dengan unit monomer sampai heksamer pada konsentrasi 20
mgml, dan kitosan sebagai standarnya Jeon dan Kim 2000; Wahyuni 2006.
4. Uji Toksisitas Meyer, et al, 1982
Telur
;
sa lin
a dimasukkan dalam air laut yang telah diaerasi. Setelah 48 jam telur akan menetas dan siap digunakan untuk uji toksisitas. Kemudian
dikelompokkan dalam 6 sumur dan masing-masing diberi ekstrak sampel oligomer kitin 1 sebanyak 0 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan
250 ppm. Masing-masing sumur dimasukkan 10 larva udang. Gejala toksisitas diamati dalam 24 jam kemudian dari data kematian dilakukan perhitungan LC
50
, dengan menggunakan analisis probit.
5. Pengujian Aktivitas Senyawa Oligomer terhadap Proliferasi Sel Limfosit a. Persiapan Media Kultur Sel dan Sampel Oligomer Hidrolisat Kitin
Media untuk kultur dan pemeliharaan sel menggunakan RPMI-1640 bubuk sebanyak 10,4 gram dan dilarutkan dalam air deionisasi sampai volume 1satu
liter. Kemudian ditambahkan NaHCO
3
2 gram, Glutamin 2 mM sebanyak 10 ml dan antibiotik penisilin-streptomisin 0,2, kemudian dilakukan sterilisasi dingin
dengan membran steril berukuran 0,22 m. Jika digunakan sebagai media
pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10 FBS steril Zakaria 1997. Persiapan sampel dilakukan untuk menguji aktivitas proliferasi sel limfosit
oleh senyawa-senyawa oligomer kitin, yaitu terlebih dahulu ditetapkan besarnya konsentrasi senyawa oligomer kitin hasil fraksinasi hidrolisat enzimatik yang akan
digunakan.
