C. Diagram Alir Penelitian
+
Gambar 6. Diagram alir proses produksi senyawa-senyawa oligomer hidrolisat kitin
Keterangan : Bahan baku
Proses HasilData
Pemanasan 60
o
C, 20 menit
Pemurnian dengan kolom hidrofobik
Analisis aktivitas dan kadar protein enzim
Deteksi kemurnian, SDS PAGE silver staining
Hidrolisat Fraksi bebas sel FBS
Preparat enzim murni EM
Pengumpulan fraksi enzim hasil pemurnian
Koloidal Kitin 1
Senyawa-senyawa Oligomer
Koloidal kitin
Produksi enzim
Enzim kasar
n ku
b a
si 4 hari Sentrifugasi selama 10
menit pada 10.000 rpm
Inokulum Media B.cereus SW41
+
Gambar 7. Diagram alir uji toksisitas dengan
+
a lin
a McLaughlin 1998
Gambar 8. Diagram alir aplikasi senyawa-senyawa oligomer hidrolisat kitin
Senyawa-senyawa Oligomer
Pengujian Proliferasi Sel Limfosit
Fraksinasi dengan HPLC preparatif
Mono - Pentamer
Pengujian Proliferasi Sel Kanker
Sebanyak 20 mg telur sa
lin a
Pemasukan dalam 500 ml air laut dengan aerasi
Pencahayaan 48 jam
Pengamatan dan penghitungan
, -
sa lin
a yang mati
han NaCl
Penambahan NaCl
Pemasukan 10 ekor
, -
sa lin
a ke dalam
tabung reaksi yang berisi 3 ml air laut yang dicampur ekstrak oligomer 100,
125, 150, 200, 250 ppm dan kontrol
Pencahayaan 24 jam
Penentuan LC50
D. Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri dari empat bagian utama yaitu : 1. Kajian produksi senyawa-senyawa oligomer hidrolisat kitin yang bersifat
bioaktif secara enzimatik, pada kegiatan ini dilakukan produksi enzim kitinase dari
.0
illu s cereu
s SW41, dilanjutkan dengan studi kondisi produksi
senyawa-senyawa oligomer hidrolisat dari kitin dengan menggunakan metode inkubasi langsung enzim dan substrat. Preparat enzim kasar, pemekatan dengan
amonium sulfat dan enzim murni, masing-masing pada berbagai konsentrasi enzim dan waktu inkubasi digunakan sebagai preparat enzim dalam produksi
senyawa-senyawa oligomer hidrolisat dari kitin. 2. Fraksinasi senyawa-senyawa oligomer dalam hidrolisat hasil reaksi enzimatik
dengan tujuan untuk memperoleh fraksi-fraksi oligomer hidrolisat dari kitin. 3. Uji toksisitas adalah uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi
senyawa-senyawa oligomer hidrolisat kitin terhadap
12 3
4
in a .
4. Kajian bioaktivitas senyawa-senyawa oligomer hidrolisat kitin terhadap proliferasi sel limfosit dan sel kanker, melalui pengujian aktivitas proliferasi
limfosit dan proliferasi sel-sel kanker secara in vitro
.
1. Produksi Enzim Kitinase
Enzim kitinase dihasilkan melalui beberapa tahap yang meliputi pembuatan kolidal kitin sebagai substrat, persiapan media, persiapan isolat
. 2
cereu s
SW41 yang digunakan sebagai sta rter
, dan produksi enzim pada kondisi optimumnya. Enzim fraksi supernatan bebas sel diproses lebih lanjut dengan
pemanasan pada 60
o
C selama 20 menit. Enzim fraksi amonium sulfat dengan konsentrasi 80 jenuh, sedangkan enzim murni dihasilkan melalui kolom
kromatografi interaksi hidrofobik.
Pembuatan Koloidal Kitin. Kedalam Erlenmeyer dimasukkan 20 gram
kitin p ra
ctica l g
ra d
e sig m
a dilarutkan ke dalam 400 ml HCl dengan liofilisasi.
Campuran dibiarkan 24 jam pada suhu 4
o
C. Setelah disaring menggunakan kertas saring, filtrat ditambah 200 ml akuades dingin dan pH larutan di atur menjadi 7.0
dengan menambahkan secara perlahan-lahan NaOH 10 N. Filtrat kemudian di sentrifugasi pada 7000 rpm selama 10 menit. Filtrat dibuang dan pellet
ditambahkan dengan akuades dingin kemudian di sentrifugasi lagi dengan kondisi yang sama. Pelet koloidal kitin disimpan pada suhu 4
o
C Arnold dan Solomon, 1986.
Produksi Enzim Fraksi Supernatan Bebas Sel FBS. Isolat bakteri
56
cereu s
SW41 ditumbuhkan pada media cair yang mengandung koloidal kitin 0,5, MgSO
4
.7H
2
O 0,01, K
2
HPO
4
0,1, yea st extract
0,1, Amonium sulfat 0,7 dan Bacto trypton 0,1. Biakan diinkubasi pada inkubator berpenggoyang
120 rpm suhu 55
o
C selama empat hari Wahyuni, 2008. Biakan disentrifugasi pada suhu 4
o
C pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan mengandung enzim ekstrak kasar dipisahkan dari endapannya untuk digunakan
dalam tahap selanjutnya.
Produksi Fraksi Enzim Murni EM. Enzim murni dihasilkan dengan
teknik kromatografi kolom hidrofobik Wahyuni, 2006. Proses pemurnian di awali dengan pemberian amonium sulfat 30 pada supernatant bebas sel, 75 ml
supernatant tersebut dimasukkan pada kolom hidrofobik bermatriks butyl separose yang sebelumnya telah di ekuilibrasi dengan buffer fosfat 0,05 M pH 4 yang
juga mengandung amonium sulfat 30 bufer A. Elusi gradient dilakukan menggunakan buffer fosfat 0,05 M pH 4, dengan konsentrasi amonium sulfat
15 dan 0, dengan laju alir 2 mljam. Volume fraksi yang ditampung masing- masing sebanyak 3 ml. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar protein pada
panjang gelombang 280 nm dan aktivitas kitinase pada panjang gelombang 420 nm pada tiap fraksi. Penggunaan SDS-PAGE dengan pewarnaan perak dilakukan
untuk mendeteksi kemurnian enzim. Fraksi dengan posisi pita yang sama kemudian dikumpulkan dan digunakan untuk produksi senyawa-senyawa
oligomer.
Pengujian aktivitas enzim kitinase. Aktivitas kitinase diuji dengan
metode Ueda dan Arai 1992 yang dimodifikasi. Koloidal kitin 1, bufer fosfat 0,05 M pH 4, dan larutan enzim kitinase filtrat bebas sel masing-masing
sebanyak 50 l di vortex dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 70
o
C. Reaksi dihentikan dengan inkubasi pada suhu -10
o
C selama 15 menit. Jumlah gula reduksi ditentukan dengan metode Schales dengan N-asetil glukosamin sebagai
Kategori