c. Uji Proliferasi Sel Limfosit
Suspensi sel dimasukkan ke dalam sumur-sumur microplate sebanyak 80 L tiap sumur. Suspensi sel dengan konsentrasi 10. Oligomer ditambahkan
dalam sumur sebanyak 20 l, m
ito g
en co
n ca
va lin
=
con A dan pokeweed sebagai kontrol masing-masing ditambahkan ke dalam sumur sebanyak 20
l. Jumlah total volume dalam tiap sumur sebanyak 100 l. Kultur diinkubasi pada
inkubator suhu 37
o
C, 5 CO
2
, RH 90 selama 3 hari Wahyuni, 2006. Metode ini menggunakan pereaksi garam tetrazolium MTT 10
L larutan MTT pada tiap sumur yang diinkubasi dengan sampel sel limfosit yang
sebelumnya telah diberi senyawa oligomer kitin dan diinkubasi selama waktu tertentu, reaksinya dilakukan pada plat ELISA selama 4 jam untuk sel limfosit dan
galur kultur sel selapis, serta 24 jam untuk galur kultur suspensi sehingga terbentuk senyawa formazam berwarna biru dan tidak larut. Untuk melarutkan
senyawa formazam digunakan 100 L isopropanol tiap sumur, kemudian hasilnya dibaca dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 595 nm Kawaii,
1999. Metode MTT tersebut bertujuan untuk membedakan sel hidup dan sel yang mati atau rusak. Data absorbansi perlakuan masing-masing menggunakan
ulangan sebanyak 3 kali, dihitung dan dikonversi ke rumus : - Untuk aktivitas proliferasi sel limfosit :
IS = Proliferasi = Absorbansi sampel Abs Kontrol x 100
6. Pemeliharaan Kultur Sel Kanker Ananta 2000 Sel Suspensi : Sel dalam keadaan beku yang tersimpan di dalam tangki
berisi nitrogen cair setelah dikeluarkan, mengalami proses thawing, terlebih dahulu, yaitu ampul berisi sel diinkubasi pada suhu 37
o
C atau digenggam dengan tangan sampai isi ampul mencair. Ampul selanjutnya disentrifugasi pada 228 x g
selama 10 menit, supernatan dibuang dan pelet ditambah medium basal RPMI, kemudian disentrifugasi kembali pada 228 x g selama 5 menit, supaya bahan-
bahan pengawet sel dan sel yang telah mati dapat dihilangkan dari kultur sel. Pelet sel kemudian ditambahkan media pertumbuhan dan dihomogenisasi, selanjutnya
suspensi sel dipindahkan ke dalam flask dengan media pertumbuhan 5 ml, lalu diinkubasi pada inkubator dengan 5 CO
2
pada suhu 37
o
C.
Sel Selapis monolayer : Pemeliharaan sel selapis sama dengan sel
suspensi, hanya dalam pencucian atau pergantian media di dalam flask diperlukan larutan enzim tripsin 0.02 di dalam 0,5 EDTA-PBS, untuk pengangkatan sel
yang melekat pada dinding flask. Media yang akan diganti mula-mula di buang semua sehingga hanya tersisa sel yang melekat di dinding flask, kemudian
ditambahkan larutan tripsin sebanyak 500 µl untuk volume kultur 5 ml dan diinkubasi pada inkubator selama 8 delapan menit. Sel yang menempel akan
terlepas, kemudian ditambahkan PBS secukupnya sebelum suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan dilakukan prosedur pencucian sel
seperti yang telah dilakukan pada sel suspensi.
7. Pengujian Aktivitas Anti Proliferasi Sel Kanker Secara in vitro Media Sel Kanker. Media DMEMF 12 Dulbecco s Modified Eagle
Medium bubuk sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam botol steril yang berisi 900 ml aquabides steril dan dihomogenisasi dengan stirer tanpa pemanasan.
Selanjutnya ditambahkan 12 gram NaHCO
3
, antibiotik penisilin-streptomisin 0,2, dihomogenisasi kembali dan ditambahkan akuabides sampai larutan media
menjadi 1000 ml. Media disaring menggunakan kertas saring steril ukuran 0,22 m secara aseptik dan hasil penyaringan dimasukkan dalam botol steril dan
disimpan dalam lemari es pada suhu 2 8
o
C sampai digunakan kembali. Apabila akan digunakan sebagai media tumbuh media DMEMF12 ditambahkan 10 FCS
Rusmarilin, 2003 Perhitungan sel dilakukan setelah pewarnaan sel oleh Tripan biru seperti
cara perhitungan sel limfosit yang telah dijelaskan. Suspensi sel 1 x 10
5
selml dimasukkan ke dalam sumur-sumur microplate sebanyak 180 l tiap sumur.
Hidrolisat yang mengandung senyawa-senyawa oligomer dengan konsentrasi sebesar 125 µgml ditambahkan dalam sumur sebanyak
20 l. Penggunaan kontrol positif anti kanker Doxorubicin dengan konsentrasi 5 µgml sebanyak 20
l, sedangkan kontrol negatif hanya berisi suspensi sel dan media. Jumlah total
Kategori