Produksi Enzim Kitinase Metode Penelitian
ditambahkan dengan akuades dingin kemudian di sentrifugasi lagi dengan kondisi yang sama. Pelet koloidal kitin disimpan pada suhu 4
o
C Arnold dan Solomon, 1986.
Produksi Enzim Fraksi Supernatan Bebas Sel FBS. Isolat bakteri
56
cereu s
SW41 ditumbuhkan pada media cair yang mengandung koloidal kitin 0,5, MgSO
4
.7H
2
O 0,01, K
2
HPO
4
0,1, yea st extract
0,1, Amonium sulfat 0,7 dan Bacto trypton 0,1. Biakan diinkubasi pada inkubator berpenggoyang
120 rpm suhu 55
o
C selama empat hari Wahyuni, 2008. Biakan disentrifugasi pada suhu 4
o
C pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan mengandung enzim ekstrak kasar dipisahkan dari endapannya untuk digunakan
dalam tahap selanjutnya.
Produksi Fraksi Enzim Murni EM. Enzim murni dihasilkan dengan
teknik kromatografi kolom hidrofobik Wahyuni, 2006. Proses pemurnian di awali dengan pemberian amonium sulfat 30 pada supernatant bebas sel, 75 ml
supernatant tersebut dimasukkan pada kolom hidrofobik bermatriks butyl separose yang sebelumnya telah di ekuilibrasi dengan buffer fosfat 0,05 M pH 4 yang
juga mengandung amonium sulfat 30 bufer A. Elusi gradient dilakukan menggunakan buffer fosfat 0,05 M pH 4, dengan konsentrasi amonium sulfat
15 dan 0, dengan laju alir 2 mljam. Volume fraksi yang ditampung masing- masing sebanyak 3 ml. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar protein pada
panjang gelombang 280 nm dan aktivitas kitinase pada panjang gelombang 420 nm pada tiap fraksi. Penggunaan SDS-PAGE dengan pewarnaan perak dilakukan
untuk mendeteksi kemurnian enzim. Fraksi dengan posisi pita yang sama kemudian dikumpulkan dan digunakan untuk produksi senyawa-senyawa
oligomer.
Pengujian aktivitas enzim kitinase. Aktivitas kitinase diuji dengan
metode Ueda dan Arai 1992 yang dimodifikasi. Koloidal kitin 1, bufer fosfat 0,05 M pH 4, dan larutan enzim kitinase filtrat bebas sel masing-masing
sebanyak 50 l di vortex dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 70
o
C. Reaksi dihentikan dengan inkubasi pada suhu -10
o
C selama 15 menit. Jumlah gula reduksi ditentukan dengan metode Schales dengan N-asetil glukosamin sebagai
standar. Sebanyak 200 l campuran reaksi ditambahkan 1 ml pereaksi
78
h a
les dan 800 l akuades, setelah ditutup dengan aluminium foil, tabung yang berisi
campuran reaksi dipanaskan pada suhu 100
o
C selama 10 menit, disentrifus pada 8000 rpm selama 10 menit. Absorbansi
supernatan dibaca dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Blanko berisi pereaksi
78
h a
les dan akuades sebagai pengganti larutan sampel.
Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1
mol N-asetil glukosamin per menit. Penentuan konsentrasi N- asetil glukosamin sampel berdasarkan kurva standar N-asetil glukosamin.
Pengukuran Kadar Protein. Kadar Protein dalam sampel enzim
dianalisis berdasarkan metode Bradford 1976 menggunakan Bovine serum albumin BSA pada kisaran konsentrasi 0
100 gml sebagai standar protein. Campuran reaksi mengandung 0,1 ml sampel, 1 ml akuades dan 1 ml pereaksi
Bradford. Setelah campuran reaksi dihomogenkan, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Blanko berisi peraksi Bradford dan akuades sebagai
pengganti larutan sampel.
Elektroforesis dan Pewarnaan Perak. Elektroforesis dan pewarnaan
perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim yang paling tinggi dari fraksi hasil kolom kromatografi hidrofobik. Elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamida-sodium dodesil sulfat SDS-PAGE, dengan konsentrasi gel pemisah poliakrilamida 10 dan gel penahan poliakrilamida 4 Bollag dan
Edelstein 1991. Sampel fraksi-fraksi hasil pemurnian enzim sejumlah 20 l
terlebih dahulu diinkubasi selama 5 menit pada 70
o
C dalam bufer sampel 5 l bufer sampel tanpa -mercaptoetanol. Selanjutnya dilakukan lo
a d
in g
sampel pada tiap sumur gel, kemudian proses elektroforesis dilakukan dengan kondisi
tegangan listrik 100 Volt dan arus sebesar 100 mili Amper. Setelah selesai, gel difiksasi dengan larutan fiksasi methanol 25 dan asam asetat 12 selama
semalam. Perendaman gel selanjutnya diganti dengan larutan etanol 50, 30 masing-masing selama 20 menit. Selanjutnya perendaman diganti dengan larutan
en h
a n
cer 0,1 gram Na
2
S
2
O
3
dalam 500 ml akuabides selama satu menit. Setelah gel dicuci dengan akuabides sebanyak tiga kali masing-masing selama 20 detik,
gel diwarnai dengan larutan perak nitrat AgNO
3
dalam formaldehid yang dilakukan selama 30 menit. Terakhir larutan perendam gel diganti dengan larutan
Na
2
CO
3
dalam formaldehid selama 10 menit. Kemudian dilakukan penghentian reaksi dengan larutan fiksasi, setelah pita terlihat jelas dilanjutkan dengan
penentuan berat molekul Bollag dan Edelstein, 1991.