Produksi Enzim Kitinase Metode Penelitian

ditambahkan dengan akuades dingin kemudian di sentrifugasi lagi dengan kondisi yang sama. Pelet koloidal kitin disimpan pada suhu 4 o C Arnold dan Solomon, 1986. Produksi Enzim Fraksi Supernatan Bebas Sel FBS. Isolat bakteri 56 cereu s SW41 ditumbuhkan pada media cair yang mengandung koloidal kitin 0,5, MgSO 4 .7H 2 O 0,01, K 2 HPO 4 0,1, yea st extract 0,1, Amonium sulfat 0,7 dan Bacto trypton 0,1. Biakan diinkubasi pada inkubator berpenggoyang 120 rpm suhu 55 o C selama empat hari Wahyuni, 2008. Biakan disentrifugasi pada suhu 4 o C pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan mengandung enzim ekstrak kasar dipisahkan dari endapannya untuk digunakan dalam tahap selanjutnya. Produksi Fraksi Enzim Murni EM. Enzim murni dihasilkan dengan teknik kromatografi kolom hidrofobik Wahyuni, 2006. Proses pemurnian di awali dengan pemberian amonium sulfat 30 pada supernatant bebas sel, 75 ml supernatant tersebut dimasukkan pada kolom hidrofobik bermatriks butyl separose yang sebelumnya telah di ekuilibrasi dengan buffer fosfat 0,05 M pH 4 yang juga mengandung amonium sulfat 30 bufer A. Elusi gradient dilakukan menggunakan buffer fosfat 0,05 M pH 4, dengan konsentrasi amonium sulfat 15 dan 0, dengan laju alir 2 mljam. Volume fraksi yang ditampung masing- masing sebanyak 3 ml. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar protein pada panjang gelombang 280 nm dan aktivitas kitinase pada panjang gelombang 420 nm pada tiap fraksi. Penggunaan SDS-PAGE dengan pewarnaan perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim. Fraksi dengan posisi pita yang sama kemudian dikumpulkan dan digunakan untuk produksi senyawa-senyawa oligomer. Pengujian aktivitas enzim kitinase. Aktivitas kitinase diuji dengan metode Ueda dan Arai 1992 yang dimodifikasi. Koloidal kitin 1, bufer fosfat 0,05 M pH 4, dan larutan enzim kitinase filtrat bebas sel masing-masing sebanyak 50 l di vortex dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 70 o C. Reaksi dihentikan dengan inkubasi pada suhu -10 o C selama 15 menit. Jumlah gula reduksi ditentukan dengan metode Schales dengan N-asetil glukosamin sebagai standar. Sebanyak 200 l campuran reaksi ditambahkan 1 ml pereaksi 78 h a les dan 800 l akuades, setelah ditutup dengan aluminium foil, tabung yang berisi campuran reaksi dipanaskan pada suhu 100 o C selama 10 menit, disentrifus pada 8000 rpm selama 10 menit. Absorbansi supernatan dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Blanko berisi pereaksi 78 h a les dan akuades sebagai pengganti larutan sampel. Satu unit aktivitas kitinase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 mol N-asetil glukosamin per menit. Penentuan konsentrasi N- asetil glukosamin sampel berdasarkan kurva standar N-asetil glukosamin. Pengukuran Kadar Protein. Kadar Protein dalam sampel enzim dianalisis berdasarkan metode Bradford 1976 menggunakan Bovine serum albumin BSA pada kisaran konsentrasi 0 100 gml sebagai standar protein. Campuran reaksi mengandung 0,1 ml sampel, 1 ml akuades dan 1 ml pereaksi Bradford. Setelah campuran reaksi dihomogenkan, absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Blanko berisi peraksi Bradford dan akuades sebagai pengganti larutan sampel. Elektroforesis dan Pewarnaan Perak. Elektroforesis dan pewarnaan perak dilakukan untuk mendeteksi kemurnian enzim yang paling tinggi dari fraksi hasil kolom kromatografi hidrofobik. Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamida-sodium dodesil sulfat SDS-PAGE, dengan konsentrasi gel pemisah poliakrilamida 10 dan gel penahan poliakrilamida 4 Bollag dan Edelstein 1991. Sampel fraksi-fraksi hasil pemurnian enzim sejumlah 20 l terlebih dahulu diinkubasi selama 5 menit pada 70 o C dalam bufer sampel 5 l bufer sampel tanpa -mercaptoetanol. Selanjutnya dilakukan lo a d in g sampel pada tiap sumur gel, kemudian proses elektroforesis dilakukan dengan kondisi tegangan listrik 100 Volt dan arus sebesar 100 mili Amper. Setelah selesai, gel difiksasi dengan larutan fiksasi methanol 25 dan asam asetat 12 selama semalam. Perendaman gel selanjutnya diganti dengan larutan etanol 50, 30 masing-masing selama 20 menit. Selanjutnya perendaman diganti dengan larutan en h a n cer 0,1 gram Na 2 S 2 O 3 dalam 500 ml akuabides selama satu menit. Setelah gel dicuci dengan akuabides sebanyak tiga kali masing-masing selama 20 detik, gel diwarnai dengan larutan perak nitrat AgNO 3 dalam formaldehid yang dilakukan selama 30 menit. Terakhir larutan perendam gel diganti dengan larutan Na 2 CO 3 dalam formaldehid selama 10 menit. Kemudian dilakukan penghentian reaksi dengan larutan fiksasi, setelah pita terlihat jelas dilanjutkan dengan penentuan berat molekul Bollag dan Edelstein, 1991.

2. Produksi senyawa-senyawa oligomer Hidrolisat Kitin

Senyawa-senyawa oligomer diproduksi dari koloidal kitin 1 yang dipersiapkan sebagai berikut : Preparat enzim kasar, yang berasal dari hasil pemanasan supernatan bebas sel pada suhu 60 o C selama 20 menit, konsentrasi enzim yang digunakan adalah 0,0085 Unit per miligram kitin, preparat enzim murni dari hasil pemurnian dengan kolom kromatografi hidrofobik menggunakan konsentrasi enzim sebesar 0,0085 Unit per milligram kitin Wahyuni, 2010. Pemilihan besarnya konsentrasi enzim berdasarkan perkiraan kemampuan enzim dalam menghasilkan produk reaksi senyawa-senyawa oligomer dalam besaran unit tertentu yang telah dilaporkan sebelumnya oleh Jeon dan Kim 2000. Reaksi hidrolisis enzim dengan substrat dilakukan pada suhu 60 o C suhu optimum enzim selama 6 dan 12 jam. Sampel senyawa-senyawa oligomer yang akan diuji aktivitas proliferasi sel limfosit dan anti proliferasi sel kanker kemudian ditanpa liofilisasikan dan disterilisasi dingin dengan filter membran ukuran 0,2 mikron.

3. Identifikasi dan Fraksinasi Komponen Oligomer Hidrolisat Kitin

Produk hasil hidrolisis berbagai preparat enzim dan substrat diidentifikasi pada tahap awal berdasarkan konsentrasi N-asetil glukosamin yang dihasilkan dengan metode spektrofotometri, yang merupakan lanjutan dari uji aktivitas enzim kitinase dengan metode Ueda dan Arai yang dimodifikasi. Konsentrasi N- asetilglukosamin dihitung berdasarkan kurva standar yang disiapkan dari larutan standar N-asetilglukosamin yang konsentrasinya berkisar antara 0 60 gml. Tahap selanjutnya dilakukan identifikasi dengan alat HPLC 9 ig h : erformance Liquid Cromatography. Sampel senyawa-senyawa oligomer dalam hidrolisat sebelum dianalisis dengan HPLC terlebih dahulu disentrifus untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang dapat mempengaruhi pembacaan alat HPLC. Identifikasi dan fraksinasi dengan HPLC menggunakan kolom karbohidrat waters sebagai fase diam, dan pelarut asetonitril 60 dalam air sebagai fase gerak. Deteksi dilakukan berdasarkan waktu retensi, dengan detektor UV model 440 dual lamdha, menggunakan volume injeksi sampel sebanyak 20 l dan laju alir 1 mlmenit. Sebagai standar digunakan senyawa oligomer campuran dari seikagaku Japan, dengan unit monomer sampai heksamer pada konsentrasi 20 mgml, dan kitosan sebagai standarnya Jeon dan Kim 2000; Wahyuni 2006.

4. Uji Toksisitas Meyer, et al, 1982

Telur ; sa lin a dimasukkan dalam air laut yang telah diaerasi. Setelah 48 jam telur akan menetas dan siap digunakan untuk uji toksisitas. Kemudian dikelompokkan dalam 6 sumur dan masing-masing diberi ekstrak sampel oligomer kitin 1 sebanyak 0 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan 250 ppm. Masing-masing sumur dimasukkan 10 larva udang. Gejala toksisitas diamati dalam 24 jam kemudian dari data kematian dilakukan perhitungan LC 50 , dengan menggunakan analisis probit. 5. Pengujian Aktivitas Senyawa Oligomer terhadap Proliferasi Sel Limfosit a. Persiapan Media Kultur Sel dan Sampel Oligomer Hidrolisat Kitin Media untuk kultur dan pemeliharaan sel menggunakan RPMI-1640 bubuk sebanyak 10,4 gram dan dilarutkan dalam air deionisasi sampai volume 1satu liter. Kemudian ditambahkan NaHCO 3 2 gram, Glutamin 2 mM sebanyak 10 ml dan antibiotik penisilin-streptomisin 0,2, kemudian dilakukan sterilisasi dingin dengan membran steril berukuran 0,22 m. Jika digunakan sebagai media pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10 FBS steril Zakaria 1997. Persiapan sampel dilakukan untuk menguji aktivitas proliferasi sel limfosit oleh senyawa-senyawa oligomer kitin, yaitu terlebih dahulu ditetapkan besarnya konsentrasi senyawa oligomer kitin hasil fraksinasi hidrolisat enzimatik yang akan digunakan.