disterilisasi dengan membran steril 0.22 µm. Komposisi media RPMI-1640 disajikan pada Lampiran 13.
b. Isolasi sel limfosit manusia modifikasi Yanuwar, 2009; Pertiwi, 2009
Sel limfosit diisolasi dari darah seorang pria dewasa sehat. Kegiatan pendonoran darah dilakukan di klinik Farfa Darmaga oleh seorang perawat. Darah diambil dari seorang
responden secara aseptis dengan syringe dan jarum butterfly nomor 23 steril sekali pakai yang dihubungkan dengan tabung vacutainer mengandung antikoagulan EDTA. Jumlah
darah yang diambil adalah 2 x 15 ml. Sampel darah secepatnya dibawa ke laboratorium untuk pengerjaan prosedur isolasi sel limfosit. Sampel darah dalam vacutainer selanjutnya
dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi yang dilakukan secara aseptis di dalam laminar hood untuk menjamin keaseptisan proses.
Tahap pertama dari prosedur isolasi sel limfosit adalah pemisahan komponen selular dengan sentrifugasi sampel darah pada 1500 rpm selama 10 menit. Bagian darah yang lebih
berat eritrosit berada di bagian bawah warna merah, sedangkan serum darah terpisah di bagian atas warna kuning. Lapisan buffycoat yang sebagian besar berisi sel-sel darah
putih, khususnya sel limfosit, berada diantara kedua lapisan tersebut. Lapisan buffycoat tersebut selanjutnya dipindahkan ke tabung sentrifugasi steril baru
dengan sebelumnya membuang cairan serum yang bewarna kekuningan sebanyak ± 2-5 ml. Bagian lapisan buffycoat yang diambil berjumlah ± 5 ml termasuk bagian serum dan sedikit
bagian bewarna merah muda di atas eritrosit. Kemudian, tambahkan sejumlah RPMI dengan jumlah yang sama 1:1. Kedua larutan tersebut selanjutnya dicampur dengan cara
dikocok secara manual hingga homogen. Tahap kedua dari prosedur isolasi sel limfosit adalah memisahkan sel limfosit dari sel-
sel darah putih lainnya ataupun dari sel darah merah yang masih ada dalam suspensi sel tersebut. Tahap kedua ini dilakukan dengan menyiapkan tabung sentrifugasi kosong steril
yang kemudian diisikan 3 ml larutan ficoll-hystopaque densitas 1.77 ± 0.001 gml dan kemudian melewatkan lapisan buffycoat melalui larutan ficoll-hystopaque tersebut secara
perlahan dengan cara dialirkan melalui dinding tabung sehingga terbentuk dua lapisan. Tabung tersebut kemudian disentrifugasi pada 2500 rpm selama 30 menit. Sel darah putih
yang tidak bergranula atau agranulosit, seperti sel limfosit dan monosit mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll-hystopaque sehingga posisinya akan berada di atas
permukaan yang terlihat seperti lapisan cincin putih. Sel darah merah dan granulosit akan terpisah di dasar tabung sentrifugasi karena berdensitas lebih tinggi.
Tahap ketiga adalah pengambilan lapisan cincin putih yang berisi sel limfosit dengan mikropipet secara perlahan dan dipindahkan ke tabung sentrifugasi baru yang steril.
Suspensi sel limfosit tersebut selanjutnya dicuci dengan penambahan 5 ml media RPMI. Campuran ini kemudian disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 10 menit dan
dicuci sebanyak dua kali. Setelah itu, supernatan dibuang kemudian suspensi sel limfosit ditambahkan 6 ml media RPMI dan selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah sel limfosit
awal.
c. Uji keberadaan sel limfosit dengan pewarna biru tripan modifikasi Yanuwar, 2009
Uji keberadaan sel limfosit dilakukan dengan menggunakan pewarna biru trifan. Perbandingan antara jumlah larutan sel limfosit dan RPMI dengan pewarna biru trifan
adalah 1:1 pada sumur lempeng mikrokultur, dengan jumlah 20 l masing-masing,
sehingga didapatkan faktor pengencerannya adalah 2 kali. Setelah didiamkan selama satu
menit, jumlah sel dihitung dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali.
Uji keberadaan sel limfosit ini dilakukan dengan menghitung jumlah sel dengan menggunakan pewarna biru trifan yang dimaksudkan untuk menentukan viabilitas sel yang
akan diuji, yaitu sebelum dilakukan pengujian sel harus dalam kondisi hidup sebesar 95. Untuk mengetahui angka ini, maka perlu dihitung pula jumlah sel yang mati atau rusak
pada area yang sama Puspawati, 2009. Selain viabilitas sel berdasarkan persentase, perlu diketahui juga jumlah konsentrasi
sel yang akan dikultur. Jumlah konsentrasi sel tersebut sebaiknya sekitar 1-4 x 10
6
selml Bellanti, 1993 dan ditentukan melalui asumsi bahwa sel limfosit akan mampu bertahan
hidup dan melewati siklus hidupnya selama waktu inkubasi 72 jam Paul, 1972. Jika konsentrasi sel yang terhitung rendah atau kurang dari 1.50 x 10
5
selml, maka sel tidak dapat bertahan hidup dan tumbuh Bellanti, 1993.
Sel limfosit yang hidup akan tampak transparan dan berbentuk benar-benar bulat, sedangkan sel limfosit yang rusak atau mati akan berbentuk tidak beraturan atau berwarna
biru seluruhnya. Perhitungan sel limfosit hidup dan mati dilakukan pada dua area kotak besar yang berada di pojok dan saling bersebrangan. Persamaan 5.1 digunakan untuk
menghitung konsentrasi sel yang terdapat pada suspensi sel limfosit hasil kegiatan isolasi sel limfosit. Kegiatan penghitungan ini dilakukan dalam waktu kurang dari 3 menit.
5.1 Keterangan:
Ā = Rata-rata jumlah sel terhitung dari dua area kotak besar
FP = Faktor pengenceran 2, diperoleh dari penambahan pewarna biru trifan :
suspensi sel yaitu 1:1 10
4
= Faktor koreksi volume hemasitometer yang setiap kotak sekundernya berukuran 1 x 1 mm dan kedalaman 0.1 mm, sehingga volumenya 0.1 mm
3
1 ml = 1 cm
3
= 1000 mm
3
Setelah diketahui jumlah viabilitas sel limfosit yang telah diisolasi, maka selanjutnya suspensi sel limfosit tersebut akan dikulturkan bersama larutan RPMI, larutan
mitogen, dan larutan kerja ekstrak tepung biji pearl millet tersosoh 100 detik yang telah dibuat sebelumnya. Tahapan ini merupakan tahapan pengujian aktivitas proliferasi sel
limfosit dengan MTT.
d. Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit dengan MTT modifikasi Yanuwar, 2009
